1．組織前處理在組織制片中以冷凍切片（厚10～30μm）最佳。切片貼在預(yù)先清潔，高溫處理并涂以粘附劑載玻片上，先在37℃預(yù)干燥4h，然后置于37℃烤箱中過夜。經(jīng)過上述處理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存數(shù)月之久，有報告可保存數(shù)年之久的。但仍以新鮮制片為好。如為石蠟包埋切片，應(yīng)脫蠟經(jīng)梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在細胞內(nèi)mRNA含量高時應(yīng)用二甲苯脫蠟后仍能顯示。經(jīng)水洗后入37℃烤箱4h或過夜，然后進行雜交前處理。
在烘烤及低溫保存時，為防塵埃及空氣中RNA酶的污染，宜用錫箔紙（foilpaper）包被，內(nèi)加少許干燥劑（變色硅膠）。
下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
（1）PBS洗2×3min。
（2）選擇少數(shù)幾張切片作為“RNA酶對照片”。
其它切片暫放于PBs 內(nèi)。
RNA酶對照片處理方法：加RNA酶（100μg/ml）在預(yù)熱37℃的溶液內(nèi)。放在潮濕的盛有少許2×SSC塑料盒或蒸發(fā)皿內(nèi)。在每張切片上覆以過量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC沖洗，2×3min，然后與其它保存在PBS的切片一起進行下列處理。
（3）蛋白酶K消化：將組織切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，內(nèi)含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化時間應(yīng)根據(jù)組織的種類，厚度反復(fù)試驗調(diào)整。時間過短探針不易進入，過長影響細胞或組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
（4）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min終止蛋白激酶K反應(yīng)。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
（5）在4%多聚甲醛/PBS3min。
（6）以PBs 漂洗2×3min。
（7）浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封閉非特異性結(jié)合部位。
（8）2×SSC漂洗15min。
2．雜交以含cRNA探針（0.5ng/ml）的雜交液，按每張切片10～2μl的量覆蓋切片。地高辛配基標(biāo)記的cRNA核酸探針保存濃度為2.5ng/ml，用前稀釋備用。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)ぃ糜谑⒂猩倭?×SSC溫盒內(nèi)在42℃，16～18h或過夜。
3．顯示
（1）用緩沖液1沖洗雜交后的載片2×3min。
（2）在緩沖液1中10min，室溫以封閉非特異性結(jié)合部位。
（3）拭干切片周圍的載片，注意保持切片濕潤。加數(shù)滴抗地高辛抗血清（工作濃度1：500，以緩沖液1稀釋），孵育2h，室溫。
（4）緩沖液1漂洗3×3min。
（5）浸入緩沖液210min室溫。
（6）浸入底物中孵育10～30min（或更長時間，視需要而定），底物內(nèi)含顯色BCIP/NBT，室溫。最好用錫箔紙包裹反應(yīng)盒，使顯色在黑暗中進行。定期取出切片在顯微鏡下檢測反應(yīng)強度。根據(jù)反應(yīng)強度決定延長或終止反應(yīng)。反應(yīng)顏色為紫藍色。
（7）將切片浸入緩沖液3以終止反應(yīng)。
（8）復(fù)染，可用1%伊紅、1%蘇木精、1%亮綠或5%的焦寧（又稱派咯寧丫）（pyronin 丫）10～30s。
（9）流水洗5～10min，直至水無色為止。
（10）在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在蓋片四周封固。為去除水份，在封固前可進行梯度酒精脫水，透明，DPX封固，但每步時間僅需幾秒鐘，時間過長易致褪色。
