（1）放射性碘源的選用：無載體的131I或125I均可用于碘化標記，但應盡量選用新鮮的、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運輸保存所需加入）量也增加，這將會顯著降低碘利用率及標記蛋白比放射強度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強度降低，另一方面因水的輻射化學產物增多（主要是131I源），都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na2S2O5等）量多時，會抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導致標記完全失敗。放射性碘源要用無載體的，標記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護和除污染，以及減少射線對蛋白質分子的損傷，標記投入的放射碘量不宜過大，一般以<5mCi為宜。

　　（2）放射性碘與多肽、蛋白質用量的比例：這比例對標記結果的影響很大。如上述原因，一般標記時放射性投入量不宜過多，示蹤實驗室中常規每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質用量的比值主要靠標記時投入的多肽、蛋白質用量來控制。當投入的放射碘量一定時，多肽、蛋白質用量多（即I/多肽、蛋白質比值低），能獲得高碘利用率，但所得標記蛋白比放射強度低；相反多肽、蛋白質用量少（即I/多肽、蛋白質比值高），則碘利用率降低，但所得標記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動；而當此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標記多肽、蛋白比放射性也不會再增加多少。

　　（3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應時間：氧化碘化標記法中，會導致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標記時氯胺T用量都比較大，或碘化反應時間較長，結果導致蛋白質結構和活性的嚴重損傷。氯胺T用量大，或長時間進行碘化反應，結果并不能使碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度提高多少，反而使標記多肽、蛋白活性下降。當用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時，試以各種蛋白質（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等）作微量標記，當氯胺T用量為20μg/0.1ml反應液、0～20。C反應20s，碘利用率都已接近或達到最大峰，再加大氯胺T用量和延長反應時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應增加，以達到預期的碘利用率，但決不應盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應時間（通常反應時間不要超過1min），否則會導致標記多肽、蛋白質嚴重失活，不能用于實驗。當然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會使標記失敗。一般用125I標記時，氯胺T用量要適當加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。

　　氯胺T用量減少了，Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應，實驗時加入Na2S2O5一般都是過量的。氯胺T用量大時，加入Na2S2O5的剩余量也就會隨之增加，這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質或多肽生物活性的損傷。為此，Na2S2O5用量也不應過多。只要藥品沒有變質、試劑是新配的，以重量計算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應（按反應克分子濃度計算，Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，并應迅速將標記多肽、蛋白質從反應液中分離出來，以盡量減少多肽、蛋白質活性的損傷。

　　某些蛋白質或多肽對氯胺T較敏感，還可進一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應時間、降低反應溫度，以保護蛋白質的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質或多肽的碘標記十分重要。

　　（4）碘化反應體積：系指加入Na2S2O5終止反應前液體的總量。碘化反應體積愈小，局部反應物濃度愈高，所得碘利用率和標記多肽、蛋白比放射強度就愈高。所以，標記應采用比放射標記效果。當反應液量少（<0.2～0.3ml）時，反應體積對碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度的高低影響較大；當反應液量大（>0.5～1.0ml）時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標記時，一般多控制碘化反應體積<100μl。

　　（5）碘化反應溫度：溫度升高，碘化反應速度加快，碘利用率有所增加。但總的來看，反應溫度的影響不很大，一般從0℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾，故一般在室溫下進行標記操作就可能獲得重復性好的結果。有些蛋白質或肽類極易喪失活性，則可在0℃進行碘化反應。

　　（6）碘化反應的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對多肽鏈的酪氨酸基苯環羥基鄰位的碘化作用，最適pH是7.3～7.8之間。當pH變化時，碘化位置也會發生變化，例如pH值較高時，組氧酸的咪唑環也可被碘化；當pH4～5時，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導致肽鏈斷裂。這些都會影響蛋白質或多肽的放射性碘化反應，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標記時，除放射性碘源外，所有的試劑都應用適當的緩沖液配制，保證碘化反應在最佳pH條件下進行。

　　（7）微量蛋白質或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質或多肽類時是可以忽略的，但作微量法標記時投入的蛋白質或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導致的損失就不能忽略。例如制備131I—ACTH時，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時，因表面吸附可損失10%～30%，甚至高達75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘留量隨標記蛋白比放射性強度而直線增減，殘留者幾乎全部都是標記蛋白。由此可見，微量蛋白質或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質、多肽會被顯著吸附而丟失，所以標記時投入蛋白質、多肽量過微（如<2μg）也是不適宜的，否則標記蛋白質、多肽的收回率會太低，并在計算上會造成較大的誤差。

　　（8）不同蛋白質、多肽碘化標記的差別：由于不同的蛋白質和多肽分子中含有的酪氨酸數目不同，而且其空間結構也不相同，分子中的酪按酸殘基有的容易發生碘化反應，有的就不容易碘化，因此同樣條件下進行碘化標記，不同蛋白質或多肽對碘的利用率是不相同的。不同蛋白質經碘化標記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH）、促黃體激素釋放激素（LRH）等多肽，碘化標記后容易喪失激素活性或與受體結合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化標記，則較容易保存良好的免疫化學活性。

　　盡管不同多肽、蛋白度的碘化標記結果有所差別，但上述討論的因素對不同多肽、蛋白質碘化標記的影響有共同的規律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標記物。

　　不同多肽、蛋白質的分子量大小、理化性質各不相同，放射碘化標記反應后，可根據具體情況采取不同的方法將標記蛋白質（或多肽）與未反應的游離放射性碘及受損傷的標記物分開，常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。