多數的siRNA表達載體依賴RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段45—50nt的發夾結構RNA（small hairpin RNA, shRNA）在哺乳動物細胞中的表達,shRNA在細胞內會自動被加工成為siRNA，從而引發基因沉默或者表達抑制。這一類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子等。采用RNA pol III啟動子的原因是由于它有明確的啟始和終止序列，總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉錄合成RNA，遇到4—5個連續的U即終止，并且轉錄產物在第二個尿嘧啶處被切下來，非常精確，而且還可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA。轉錄出的RNA形成發卡樣結構后，會在3’端形成2個突出的尿嘧啶，這類似于天然的siRNA,因而有利于雙鏈RNA誘發RNAi。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火后克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。克隆的過程需要幾天的時間，也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。
先在體外構建能表達雙鏈RNA的載體，再將載體轉移到細胞內在細胞內合成出雙鏈RNA，不但能增加有效轉染細胞的種類，而且在長期穩定表達載體的細胞株中，雙鏈RNA能夠長期發揮阻斷基因的作用。
現在有多個報道說通過質粒表達siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達。當這種帶有PolIII 啟動子和shRNA編碼序列的質粒轉染哺乳動物細胞時，這種能表達siRNA的質粒確實能夠下調特定基因的表達，抑制范圍包括外源基因和內源基因。
腺病毒是體內轉基因的常用載體。Xia HaiBin等用腺病毒做載體，在體內和體外表達dsRNA,并成功的阻斷了基因的表達，從而實現了成體動物的基因敲除。
最近多個廠家開始研究逆轉錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便。
主要優點：
1.是唯一可以進行長期研究的方法。雙鏈RNA只能短暫抑制哺乳動物細胞的基因表達，而具有發卡結構的雙鏈RNA能夠增加阻斷基因表達的時間。在小鼠畸胎瘤細胞，胚胎干細胞，C2C12細胞中，用長鏈具有發卡結構的雙鏈RNA有效的阻斷了報告基因的表達，在穩定表達具有發卡結構的雙鏈RNA的細胞株中，報告基因的表達被長期的阻斷了。帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。即使是對轉染帶有篩選標記質粒的細胞進行瞬時篩選，也有助于富集帶質粒的細胞。這也可以幫助解決一些難轉染的細胞由于轉染效率低造成的問題。
2.由于質粒可以復制擴增，相比起化學合成來說，能夠顯著降低制備siRNA的成本。
適用：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達siRNA的細胞。長期研究。
不適用：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。
