目前用于基因治療的載體多為此種腺病毒載體。顧名思義，這種腺病毒載體不能在除包裝細胞系（293、911、PERC6等）以外的細胞中復制增殖。其共同特點是：缺失了腺病毒基因組中某些復制增殖所必需的基因，這部分基因的功能由輔助細胞或病毒提供。

第一代腺病毒載體：

為E1和/或E3區缺失的腺病毒，容許攜帶6.5~8kb的外源基因，外源基因表達盒（包括外源啟動子、目的基因以及終止子）一般被插入到E1區所對應的部分。前面提到，E3區編碼蛋白與腺病毒逃避宿主免疫監視有關，與病毒復制增殖的關系不大，因此在構建腺病毒載體時常常被去除，以擴大腺病毒載體的裝載容量。E1區是腺病毒基因組進入細胞核后立早表達的基因，對后續其他基因的表達以及病毒復制起到至關重要的作用。但是如果腺病毒載體中保留E1區，當其感染細胞后會有大量的病毒蛋白表達，不僅對細胞有毒，還會引起很強的宿主抗病毒免疫反應。為解決這一矛盾，人們在一些細胞系的基因組中整合了腺病毒基因組左端一段包括E1區基因的序列，構建了所謂腺病毒包裝細胞系（如293、911以及PERC6等），這些細胞系可以反式提供E1區的功能，使E1區缺失的腺病毒載體增殖并產生成熟的腺病毒顆粒。雖然體外實驗表明這種方案是可行的，體內實驗卻發現第一代腺病毒載體仍會引起較強的免疫反應，使目的基因不能長效表達。造成這種現象的主要原因是：一方面許多細胞有E1樣蛋白表達，即使是低水平的表達也會激活E2區基因的功能，導致病毒復制增殖和表達晚期蛋白，甚至會產生一些可復制的腺病毒（RCA, replication-competent adenovirus）；另一方面，研究發現當以較高的MOI（感染復數，病毒/細胞 Multiply Of Infection）感染細胞時，E2區對E1區功能上的依賴可以被忽略，病毒仍可以復制并表達晚期基因。另外，第一代非增殖型腺病毒載體最多只能裝載約8kb的外源基因，這對于許多基因治療方案來說仍是遠遠不夠的。雖說存在著上述一些不足，第一代復制缺陷型腺病毒載體仍然是基因轉移的一個非常好的工具，他的轉基因能力適應于大多數的基因治療方案，能夠比較容易地獲得高滴度的病毒。它不僅可以用于基因治療，特別是腫瘤基因治療，還可以用于表達重組蛋白質以獲得基因疫苗，或是用于將目的基因轉導入對其他轉染方法不敏感的細胞株中。

第二代復制缺陷型腺病毒載體：

第二代復制缺陷型腺病毒載體在第一代的基礎上，對E2區（甚至包括E4區）基因的部分或全部進行了缺失突變。由于對腺病毒基因組進行了更多的缺失突變，第二代腺病毒載體的轉基因容量更大，允許插入最大約14kb的外源核苷酸序列。同時由于缺失了更多的腺病毒早期表達基因，如E1、E3、DNA聚合酶、IVa2以及pTP等，病毒蛋白的表達被進一步降低，由第二代腺病毒載體所引起的宿主抗病毒免疫反應與第一代比較要弱很多，因此在靶細胞中更穩定，目的基因的表達時相也更長。與第一代腺病毒載體一樣，第二代腺病毒載體的獲得有賴于輔助細胞（或）病毒提供其所缺失的反式作用元件。人們已經建立了多個細胞株用作第二代腺病毒載體的輔助細胞，如可表達E2a區的DNA結合蛋白、E2b區的DNA聚合酶、E2b編碼的末端蛋白以及可表達全部或大部分E4區蛋白的細胞株。但是由于當腺病毒的一些反式作用元件共同出現在一個細胞株內時表現出較強的細胞毒性，而且編碼這些蛋白的DNA大都是以染色體外游離的形式存在，導致這些細胞株的穩定性較差，成熟腺病毒顆粒的產量較低，病毒滴度下降。另外，盡管動物實驗已經證實第二代腺病毒載體所引起的機體免疫反應明顯弱于第一代，但仍有少量的腺病毒晚期蛋白表達，這說明若要完全去除腺病毒晚期蛋白表達需對腺病毒載體進行更加深入的改造。

第三代腺病毒載體：

即所謂空殼載體（gutless or gutted adenovirus vectors）或（hdAd, helper-dependent adenovirus vector）。有關這種腺病毒載體的設想來源于對一些無感染能力的腺病毒顆粒的觀察。研究發現，盡管這些無感染能力腺病毒顆粒的基因組成千差萬別，但是它們都共同含有腺病毒基因組最左端的一段序列，即包裝信號（ψ）。因此人們設想：構建一種腺病毒載體，僅保留包括左右端ITR以及包裝信號的約500bp的順式作用元件，去除腺病毒基因組中全部的反式作用元件，而這部分功能由輔助病毒提供。這無疑是防止腺病毒晚期蛋白表達最簡單、直接也是最有效的方法。它在保留了第一代新病毒載體基因轉在效率高等一些優點的同時，外源基因的裝載容量擴大到約37kb。由于去除了全部的腺病毒蛋白編碼序列，安全性進一步提高，引起機體免疫反應的可能性降低，因此外源基因的表達時相明顯延長，有報道稱可達一年以上。另外，由于hdAd的主要特點之一是載體的血清型是由輔助病毒決定的，只需采用不同的輔助病毒，就很容易包裝出不同血清型的空殼載體，實現血清型轉換（serotype switching），因此hdAd可以反復經系統途徑給藥，而無需擔心機體抗腺病毒中和抗體的影響。雖然hdAd有以上種種優點，但其目前還只限于臨床前研究階段，主要是因為有以下兩個技術上的難題需要解決。首先是如何去除輔助病毒的污染。用作輔助病毒多為第一代腺病毒載體，很難用常規的方法將其與hdAd完全分開。已有幾種方案用于這方面的研究，其中以拿大的Graham教授等人提出的用Cre/LoxP系統剪切輔助腺病毒包裝信號的方法最為可行，應用也最為廣泛。具體方法是在輔助腺病毒包裝信號的兩側分別插入一段同向排列的LoxP序列（P1噬菌體Cre重組酶的特異性識別位點）。這種修飾對腺病毒在293細胞內復制增殖不會造成影響，然而這種經修飾的輔助腺病毒一旦感染293來源的可穩定表達Cre重組酶的293Cre細胞，Cre酶會對包裝信號兩側的LoxP位點進行剪切，這種失去了包裝信號的輔助病毒仍然可以反式提供hdAd所需的各種腺病毒蛋白，卻不能包裝成成熟的腺病毒顆粒。借助高效特異的Cre/LoxP重組系統，hdAd與輔助腺病毒在共轉染293Cre細胞并傳過幾代之后，混雜的輔助腺病毒將降到0.1~0.01%左右。另一個需要解決的是hdAd DNA大小和填充物（stuffer）的問題。我們知道，腺病毒顆粒的有效包裝下限是野 生型腺病毒基因組長度的75%，（即約28kb）。若低于此限，則需額外插入適當的DNA充當填充物使其達到28kb以上，否則不被包裝或DNA分子發生重排。然而，DNA填充物的選擇對hdAd的功能非常重要。比如，以一段22kb長的λ噬菌體DNA為填充物的hdAd，在體外實驗時目的基因的表達量非常低，當經靜脈途徑注入小鼠體內時會引起明顯的針對λ噬菌體DNA所產生的蛋白質的CTL （cytotoxic T-lymphocytes）殺傷。相反，若是插入一段相似的人次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）則不僅會明顯地提高目的基因的表達，而且不會引起明顯的CTL殺傷。因此可以說，去除腺病毒所有的編碼序列本身并不能保證目的基因的長效表達，同時也說明填充物的選擇必須非常慎重，一般應遵守以下原則：人源化、無重復序列、無已知基因并且有與腺病毒基因組相似的GC含量。