如果兩處理間存在較大差異，以及某些基因在Tester中存在上調表達（up-regulated expression）時，用RAD方法則達不到預期目的。于是，Diatchenko. L等于1996年提出了一種可以有效克服基因上調表達所造成不利后果的克隆基因的新方法——抑制性扣除雜交（SSH）。該方法運用了雜交二級動力學原理，即豐度高的單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA。從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達到基本一致。而所謂抑制PCR，則是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)先于鏈間退火，從而使非目的序列片段兩端反向重復序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結構，無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。其具體過程第一步與RAD相同，酶切后得到Tester與Driver樣本的平末端cDNA片段。

1.將Tester cDNA均分兩份，分別接上接頭1 (adaptor 1)和接頭2 (adaptor 2)。接頭設計上，adaptor由一長鏈(40nt)和一短鏈(10nt)組成的一端是平端的雙鏈DNA片段，長鏈3′端與cDNA5′端相連。長鏈外側序列(約20nt)與第一次PCR引物序列相同，而內(nèi)側序列則與第二次引物序列同。此外，接頭上含有Ｔ7啟動子序列及內(nèi)切酶識別位點，為以后連接克隆載體和測序提供方便；
2.用過量的Driver樣品分別與兩份Tester樣品進行第一次扣除雜交，分別得到4種產(chǎn)物。這種不充分雜交使得單鏈ｃＤＮＡ分子在濃度上基本相同。同時由于Tester cDNA中與Driver cDNA序列相同片段大都形成異源雙鏈分子ｃ，使得Tester cDNA中差異表達基因得到第一次富集；
3.混合兩份雜交樣品，同時加入新的變性Driver cDNA進行第二次扣除雜交。此次雜交只有第一次雜交后經(jīng)扣除和豐度均等化的單鏈Tester cDNA能與Driver cDNA形成雙鏈分子。這一次雜交進一步富集了差異表達的cDNA，并且還形成了兩個5′端分別接不同接頭的雙鏈分子ｅ；5′填平末端，加入根據(jù)接頭長鏈序列設計的內(nèi)、外側引物進行PCR擴增。第一次PCR是基于其抑制效應，只有兩端分別是接頭1和接頭2的具差別表達的序列片段得以指數(shù)擴增。第二次PCR極大提高擴增的特異性，使得差異表達的目的基因片段得到大量富集，并可用于后續(xù)的篩選工作。

SSH自從在克隆基因的實驗中采用以來,其優(yōu)勢是非常明顯的,主要表現(xiàn)在:
1)極大降低了假陽性率,由于SSH方法采用兩次扣除雜交和兩次PCR,保證了該方法具有較高特異性。據(jù)有關報道證明SSH方法假陽性率可降至6%;
2)具高度靈敏性,由于在反應中將豐度不同的單鏈分子含量歸一化,保證了低豐度mRNA檢測成功;
3) SSH法在一次反應中,可同時分離出上百個差異表達的基因,這一點遠勝于DDRT-PCR和RAD。
而其缺點與RAD類似。