高效液相層析法的基本概念和分離理論與經典的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動力學理論等都可用于高效液相層析。
⒈高效液相層析儀典型的高效液相層析儀包括輸液系統、層析柱與檢測系統三部分。流動相用一高壓泵輸入。這種高壓泵應滿足以下條件：①流量恒定，無脈動，并有較大的調節范圍。②能抗溶劑腐蝕。③有較高的輸出壓力，一般要達到15～300kg/c，也有的高達800kg/c。④泵的死體積要小。梯度洗脫裝置必須具備兩臺高壓泵，一臺輸送強溶劑，一臺輸送弱溶劑，兩泵運轉速度用電腦控制，并可按一定的要求改變流動相的組成，以改善分離效果。一般用微量注射器直接進樣，也可采用六通閥門進樣。HPLC中所用的檢測器最多應用的是紫外吸收檢測，靈敏度可達ng水平。此外，還有熒光檢測器、示差析光檢測器、電化學檢測器等。
⒉HPLC的類型與應用
⑴液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調節試樣組份的滯留時間長短，并對試樣中某幾個組份具有選擇性作用。流動相中底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環已烷、戊烷、石油醚等，洗脫劑則根據試樣性質選用針對性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分離異構體、抗氧化劑與維生素等。
⑵液-液分配層析：固定相為單體固定液構成。將固定液的官能團結合在薄殼或多孔型硅膠上，經酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學鍵合相層析。另一種利用離子對原理的液-液分配層析為離子對層析。化學鍵合層析分：①極性鍵合相層析：固定相為極性基團，氰基、氨基及雙羥基三種。流動相為非極性或極性較小的溶劑。極性小的組份先出峰，極性大的后出峰，這稱為正相層析法，適用于分離極性化合物。②非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動相用強極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機鹽緩沖液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的硅羥基，防止因吸附而至的拖尾現象。極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。本法適用于小分子物質的分離，如肽、核苷酸、糖類、氨基酸的衍生物等。離子對分配層析分：①正相離子對層析：此法常以水吸附在硅膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對離子以一定濃度溶于水或緩沖液涂漬在硅膠上。流動相為極性較低的有機溶劑。在層析過程中，待分離的離子與水相中配對離子形成中性離子對，在水相和有機相中進行分配，而達到分離。本法優點是流動相選擇余地大，缺點是固定相易流失。②反向離子對層析：固定相是疏水性鍵合硅膠，如C18鍵合相，待分離離子和帶相反電荷的配對離子同時存在于強極性的流動相中，生成的中性離子對在流動相和鍵合相之間進行分配，而得到分離。本法優點是固定相不存在流失問題、流動相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。
⑶離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。流動相主要是水溶液，pH值最好在被分離酸、堿的pK值附近。
