氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結果，而必須由已知標準作對照定性。當無純物質(zhì)對照時，定性鑒定就很困難，這時需借助質(zhì)譜、紅外和化學法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點可高效液相色譜法來克服。在經(jīng)典液相色譜的基礎上，引入了氣相色譜的理論與技術，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個樣品往往長達幾小時至幾十小時，因此工作效率很低。人們曾對這種經(jīng)典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來提高流速，以縮短分離時間，但是結果失敗了。根據(jù)液相色譜理論，因為隨著載液（流動相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會顯著降低。隨著生產(chǎn)技術的提高，人們制成了細小（<10μm）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達到1～10mL/min。從而使分析一個多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術和計算機技術的應用，70年代以業(yè)逐步實現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現(xiàn)代液相色譜，以區(qū)別于經(jīng)典液相色譜。高效液相色譜法的分類與經(jīng)典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態(tài)不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。

高效液相色譜所用基本概念：

保留值等色譜分析有關術語，以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相，則速率議程H=A B/? C?。式中：縱向擴散項（分子擴散項）B/?對板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動相中的擴散系數(shù)Dm僅為氣相色譜中的萬分之一，因此縱向擴散項對板高的影響可以忽略不計。于是影響液相色譜的主要因素是傳質(zhì)項Cu。由圖14—可知，氣相色譜（GC）的流動相流速u增大時，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說明高效液相色譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權數(shù)種，其性質(zhì)差別也不大，對分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類多，性質(zhì)差別也大，對分離效果影響顯著。因此流動相的選擇很重要，并且在選擇流動相對應注意以下幾點：流動相對樣品有適當?shù)娜芙舛龋�但不與樣品發(fā)生化學反應，也不與固定液互溶；流動相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進雜質(zhì)和組分在流動相中擴散系數(shù)下降；流動相應與所用檢測器相匹配，不應對組分檢測產(chǎn)生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點，還由于它的流動相（載液）種類比氣相色譜的流動相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動相，從機時可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結構提供純樣品。由于高效液相色譜法具有以上特點，它適于分離、分析沸點高、熱穩(wěn)定性差、分子量大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機物和一些無機物，而這些物質(zhì)占化合物總數(shù)的75～80%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環(huán)芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機化合物以及多種無機鹽類的分離和分析。但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對于氣體和易揮發(fā)物質(zhì)的分析方面也遠不如氣相色譜法，因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長補短，相輔相成。

1.分離原理
凝膠色譜，又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進行分離、分析的方法。凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內(nèi)填充具有一定大小孔穴的凝膠。當樣品進入色譜柱后，不同大小的樣品分子（圖14—2中以黑點表示）隨流動相沿凝膠顆粒（圖14—2中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過凝膠柱而較早地被流動相沖洗出來。中等體積的分子產(chǎn)生部分滲透作用，小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個平衡過程而較晚地被流動相沖洗出來。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜柱，從而實現(xiàn)分離目的。光凝膠色譜采用水溶液作流動相進，稱為過濾凝膠色譜（HFC），而用有機溶劑為流動相時，稱為凝膠滲透色譜（GPC）。

2．固定相
凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立柱網(wǎng)狀結構的多聚體。根據(jù)凝膠的交聯(lián)程度和含水量的不同，分了軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)三種。軟質(zhì)凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯(lián)度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用于高壓（使用壓力低于3.5kg/㎝2或更低），主要用于含水體系的常壓凝膠色譜，半硬質(zhì)凝膠（如苯乙烯一二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠），容量中等，滲透性較高，壓力可用到70kg/㎝2。適用于非水溶劑流動相；硬質(zhì)凝膠（如多孔硅膠、多也玻球等），膨脹度小，不可壓縮，滲透性好，可耐高壓，適于高流速下操作。

3．流動相
在凝膠色譜中，為提高分率效率，多采用低粘度、與樣品折光指數(shù)相差大的流動相。常用的流動相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。