凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種.
一、瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離純化和
鑒定核酸的方法.瓊脂糖是從海藻中提取的一種線(xiàn)狀高聚物.根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度，
把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖.低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為62～65℃，溶解后在
37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連
接等.
(一)凝膠濃度:凝膠濃度的選擇依DNA分子的大小而定.
瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍
| 瓊脂糖濃度(%) | 線(xiàn)型DNA分子的分離范圍(Kb) |
| 0.3 | 5～60 |
| 0.6 | 1～20 |
| 0.7 | 0.8～10 |
| 0.9 | 0.5～7 |
| 1.2 | 0.9～6 |
| 1.5 | 0.2～3 |
| 12.0 | 0.1～2 |
(二)電泳緩沖液
核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE
與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使
DNA沉淀.TAE緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用TBE.緩沖液中的EDTA可螯合
二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解.
10XTBE緩沖液的配制
Tris鹼，108克
EDTA，9.3克
硼酸，55克
H2O至，1000ul
(其PH應(yīng)為8.0～8.2)
臨用時(shí)用水稀至0.5XTBE(20倍稀釋.
(三)核酸電泳的指示劑與染色劑
1.指示劑:核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中
呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、
0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線(xiàn)性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在
1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線(xiàn)性DNA大致相似.
指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用有①增加樣
品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi).②在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指
示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置.③使樣品呈色，使加樣操作更方便.
染色劑:核酸電泳后，需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其
次是銀染色.
溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)
之間，在紫外線(xiàn)激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光.根據(jù)情況可在凝膠電泳液中加入終濃度為
0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min.瓊脂
糖凝膠EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當(dāng)溴化乙錠太多，凝膠染
色過(guò)深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀(guān)察.
銀染色:銀染色液中的銀離子(Ag )可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛
使Ag 還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色.
也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收.
(四)電泳
1.電泳裝置:
電泳裝置主要有電泳儀，電泳槽及灌膠模具等.
2.電泳方法:
(1)用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈.放在水平桌面上，并架好梳子.
(2)根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200～400bp的DNA片段，
可配制1.2～1.7%濃度的瓊脂糖用于電泳.
3.配制0.5XTBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱(chēng)取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋
或微波爐內(nèi)加熱熔化.冷卻至60℃(需要時(shí)可加入溴乙錠)，倒入電泳槽中，待凝固.
4.向電泳槽中倒入0.5XTBE，其量以沒(méi)過(guò)膠面2mm為宜，小心移去梳子.如樣品孔內(nèi)有
氣泡，應(yīng)設(shè)法除去.
5.在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi).
6.接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)(靠近加樣
孔的一端為負(fù)).電壓為1-5V/cm(長(zhǎng)度以?xún)蓚�(gè)電極之間的距離計(jì)算).
7.根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳.一般200～400bp的PCR產(chǎn)物50V電壓，電泳20～40min即可.
(3)溴化乙錠染色后，紫外儀上觀(guān)察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小.
二、聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其裝載的樣品量大，回收DNA純度高.長(zhǎng)度僅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分離.
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和過(guò)硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠.
聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍見(jiàn)表2.
| 丙烯酰胺(%) | 有效分離范圍(bp) | 溴酚蘭* | 二甲苯青* |
| 3.5 | 100～2000 | 100 | 460 |
| 5.0 | 80～500 | 65 | 260 |
| 8.0 | 60～400 | 45 | 160 |
| 12.0 | 40～200 | 30 | 70 |
| 15.0 | 25～150 | 15 | 60 |
| 20.0 | 10～100 | 12 | 45 |
*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對(duì)數(shù)目(bp).
(一)材料
1.電泳儀器:電泳儀，垂直電泳槽及其附件.
2.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N'一亞甲基雙丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml裝于棕色瓶?jī)?nèi)，4℃可保存二個(gè)月.
3.10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酰銨，1克加水至，10ml
4℃可保存一周，-20℃可保存一個(gè)月.
4.1XTBE電泳緩沖液
5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)
(二)聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳:
根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠.
1.按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出.
2.將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角.
3.按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù).
4.加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止.
5.立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙樱芮凶⒁夥乐故猃X下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì).
6.室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTBE緩沖液.
7.小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊螅嶙由衔降募澳z頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則.
8.將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不要產(chǎn)生氣泡.
9.接好電極，電壓為1-8V/cm，進(jìn)行電泳.
10.根據(jù)指示劑遷移位置來(lái)判定是否終止電泳.
11.電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶液中，15～30min后取出水洗紫外儀下觀(guān)察結(jié)果.
12.聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng以上量的DNA條帶.要求更高的靈敏度，可用銀染.
