對未知突變進行分析的方法
1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage)在一定條件下,異源雙鏈核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中的錯配堿基可被RNaseA切割,切割產(chǎn)物可通過跑變性膠得到分離。RNA探針可通過將相應的DNA片段克隆至含有SP6或T7啟動子的載體中得到,當RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時,RNaseA在錯配處的切割效率很低甚至不切割,而當錯配堿基為嘧啶時,則其切割效率較高。所以如果僅分析被檢DNA的一條鏈,其突變檢出率只有30%,而如果同時分析被檢DNA的正義鏈和反義鏈,則有效率可達到70%[1]。盡管RNaseA切割法有其局限性,如需使用同位素,需將PCR產(chǎn)物克隆至表達載體上,從而增加了操作的復雜度,但由于它能對1～2kb的片段進行檢測,并能確定突變位置,且無需使用有害化學試劑,故仍被頻繁使用。
2.變性梯度凝膠電泳(DGGE)
該方法的原理是:雙鏈DNA分子在一定變性劑濃度的凝膠上電泳時,會在一定的時間發(fā)生部分解鏈,導致電泳遷移率下降,當正常的DNA分子和發(fā)生突主的DNA分子之間即使只有一個堿基對的差異時,也會在不同時間發(fā)生部分解鏈,從而被分離成兩條
3. 雜合雙鏈分析法(HA)
由突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一個凸起,在非變性膠中電泳時,會產(chǎn)生與相應的同源雙鏈DNA不同的遷移率,從而使兩者被分離開。該方法原理與單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)相似,只不過SS-CP分離的是單鏈,而HA法分離的是雙鏈。HA法簡單迅速,但只適用于200～300pb的片段,且不能確定突變位置,檢出率只有80%左右,有人建議將HA法和SSCP法聯(lián)合使用,可能將檢出率提高到接近100%[4],也有科研工作者建議使用缺失的野生型等位基因來提高該方法的靈敏度
4. 化學切割錯配(CCM)
化學切割錯配是在Maxam-Gilbert測序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項突變檢測技術(shù),在DNA∶DNA或DNA∶RNA異源雜合雙鏈核酸分子中,錯配的C能被羥胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,錯配的T能被四氧化鋨(Osmiumtetroxide)所切割,切割產(chǎn)物跑變性膠電泳即可確定是否存在突變。只要操作得當,不會發(fā)生非特異性切割,如果對正義鏈和反義鏈都進行分析,可使檢出率達到100%;使用熒光檢測系統(tǒng)將會大大增強該方法的靈敏度,從而可檢測出十個細胞中的一個突變細胞[7]。該方法的最大優(yōu)點是能對長至2kb的片段分析,并能確定突變位置,缺點是步驟多,費時,且需接觸有毒的化學物質(zhì)。
5.碳化二亞胺檢測(Carbodiimide,CDI)與CCM法相似,CDI能夠?qū)﹀e配的G和T進行修飾,當用標記的引物對CDI修飾過的雙鏈DNA進行DNA合成時,延伸會在修飾過的堿基處終止下來,合成產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠電泳即可檢測出是否有突變。該方法的最大優(yōu)點也是能對1～2kb的片段進行分析,突變檢出率達到100%,能確定突變位置,并且CDI是一種沒有毒性的物質(zhì),有報道曾用該法檢測出了7.2kbDNA片段中的一個點突變,但當一個DNA片段中存在多個突變時,該方法就不適用。
6.酶促切割錯配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)
EMC是一種與RNaseA切割相類似的方法,T4核酸內(nèi)切酶 是一種分解酶(resolvase),能夠識別12種錯配的堿基并在錯配堿基的附近進行切割,酶切產(chǎn)物跑變性膠或中性膠即可檢測出是否有突變[9],電泳產(chǎn)物的檢測可用放射自顯影,也可用銀染。由于該法能對DNA∶DNA異源雜合分子進行分析,因而省去了體外轉(zhuǎn)錄的步驟,其最長檢測片段可達到1.5kb,該法的缺點是存在非特異性切割現(xiàn)象,并且對有些錯配堿基的識別不是100%,因此在每次檢測時都必須設(shè)有一個內(nèi)對照。
7.單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandCon-formationalPolymorphism,SSCP)
該方法的原理是[10]:單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu),這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成,即使是一個堿基的不同,也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)并引起在非變性電泳條件不同的電泳遷移率
8.切割片段長度多態(tài)性
(CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP)CFLP技術(shù)是在限制性酶切片段長度多態(tài)性(RELP)和SSCP基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種基因突變檢測技術(shù),其原理是:雙鏈DNA變性后形成的單鏈在中性條件下形成二級結(jié)構(gòu)(包含多個折疊的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)),正如SSCP一樣,這種二級結(jié)構(gòu)取決于DNA的核苷酸組成和順序,即使有一個堿基的差異,也會形成不同數(shù)目的折疊狀發(fā)夾結(jié)構(gòu),而CleavaseI外切酶能識別這種發(fā)夾結(jié)構(gòu),并在該結(jié)構(gòu)的附近進行切割,切割產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠檢測,突變的DNA將出現(xiàn)與正常對照不同的酶切圖譜
9.DNA測序(Sequencing)
由各種突變檢測技術(shù)檢測到的突變最后都得由測序來確定突變類型及突變位置,而且測序法檢測突變的效率達到100%,基于此,有科研工作者提出對一些比較小,外顯子比較少的基因的突變檢測直接用測序來進行,如CMTX的CX32基因的突變分析[16],但該方法需要較多的勞力,且需接觸同位素,由PEABD公司推出的DNA自動測序儀使用四色熒光標記代替了原來手工測序的同位素標記,并且測序和分析數(shù)據(jù)的時間也大大縮短,但缺點是花費昂貴,所以對一些較大的,外顯子較多的基因不宜用測序法直接檢測突變,同時也不適用于臨床對大量的標本進行檢測,此外,測序也不能被當成是突變檢測的金標準,雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數(shù)據(jù)。
10.雙脫氧指紋圖譜法(DideoxyFinger-printing,ddF)
由于SSCP檢測方法的靈敏度受到電泳溫度、PCR片段大小等因素的影響,而直接DNA測序的方法又費時、費錢,因此有研究工作者在實際應用中將SSCP和Sanger雙脫氧測序法結(jié)合起來形成一種新的突變檢測方法,即ddF[16]。該方法的基因原理是:將PCR產(chǎn)物回收純化后用兩個引物分別做Sanger雙脫氧測序反應,但不同的是僅加入一種雙脫氧終止劑,反應產(chǎn)物跑中性聚丙烯酰胺凝膠電泳如果確有突變的話,在病人的電泳圖譜上將會丟失或獲得一條帶或者至少有一條帶的遷移率會發(fā)生改變。在ddF方法中,DNA鏈的遷移率不僅取決于其二級結(jié)構(gòu),而且與其大小相關(guān),因而較SS-CP法更為靈敏。MartincicD等曾經(jīng)將SSCP法和ddF法進行了比較,發(fā)現(xiàn)ddF能將10種已知的p53抑瘤基因突變?nèi)繖z測出來,而SSCP法只能檢測到10種突變中的6種。ddF法的靈敏度不受電泳溫度的影響,所能檢測到10種突變中的6種。ddF法的靈敏度不受電泳溫度的影響,所能檢測的PCR產(chǎn)物長度也能達到近500bp,并且該法還能對突變位置進行相對定位。該法的主要缺點是需要使用同位素,同時對回收的PCR產(chǎn)物純度要求較高,非特異的PCR產(chǎn)物將嚴重影響到最后結(jié)果的分析。
11.錯配接合蛋白檢測
從Ecoli中分離的一種DNA錯配接合蛋白能在異源雜合雙鏈DNA中的錯配堿基處接合DNA,接合后的產(chǎn)物跑測序膠,可通過電泳遷移率的改變檢測是否有突變[17]。該方法的優(yōu)點是操作簡單,可一次處理大量的樣品,但據(jù)報道這種DNA錯配接合蛋白對單堿基錯配的接合程度不如對幾個堿基錯配的接合那么強,并且這種蛋白對非錯配區(qū)也有一定的結(jié)合從而導致背景增高,最近有研究工作者建議將幾種DNA錯配接合蛋白聯(lián)合起來使用將會提高突變檢測的準確率[18],但總的來說該方法有待于進一步發(fā)展。
13.變性的高效液相色譜檢測(DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC)DHPLC技術(shù)是一項在SSCP和DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術(shù),其原理與DGE類似,即通過HPLC在部分變性的條件下可將發(fā)生錯配的異源雜合雙鏈DNA和完全匹配的同源雙鏈DNA分離開來[21]。DHPLC技術(shù)曾被用來進行比較DNA測序[22],目前在Stanford的一個研究小組正在利用該技術(shù)檢測與疾病相關(guān)的基因突變。與傳統(tǒng)的雜合雙鏈分析技術(shù)相比較,該技術(shù)花時短,分析一個樣品一般僅需5分鐘,不需使用放射性同位素,自動化程度高,但是需要另處購買一臺HPLC儀器。雖然目前該技術(shù)主要用來檢測200～300bp大小的DNA片段,長的DNA片段的檢測尚未見報道,但研究工作者對此持樂觀態(tài)度。
14.DNA芯片技術(shù)(DNAchip)
DNA芯片技術(shù)是90年代以來發(fā)展起來的一項新技術(shù),該技術(shù)結(jié)合了集成電路計算機、半導體、激光共聚集掃描,熒光標記探針和寡核苷酸DNA合成等技術(shù),充分體現(xiàn)了生物學技術(shù)與其它重要的作用,如基因定位,DNA測序,物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等,同樣,在基因突變檢測方法,DNA芯片技術(shù)的前景也令人鼓舞,其基本原理是:許多已知順序的寡核苷酸DNA被排列在一塊集成電路板上,彼此之間重疊一個堿基,并覆蓋整個所需檢測的基因,熒光標記的正常DNA和突變DNA分別與兩塊DNA芯片雜交,由于至少存在一個堿基的差異,正常DNA和突變DNA將會得到不同的雜交圖譜,通過共聚焦顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號即可確定是否存在突變。
15.等位基因特異性擴增
16.等位基因特異性寡核苷酸片段分析(Allele-SpecificOligonucleotide,ASO)17.引物延伸檢測(PrimerExtension,PEX)PEX
18.寡核苷酸連接檢測(OligonucleotideLigationAssay,OLA)
19.限制性片段分析(RestrictionFragmentAnalysis)
