（一）材料及試劑
1．器材
⑴細(xì)胞培養(yǎng)板：滅菌的國產(chǎn)96孔或40孔平底聚苯乙烯塑料板或進(jìn)口96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
⑵50μl、100μl、300μl微量加樣器，滅菌的塑料滴頭。
⑶無菌透明膠帶，其密度與塑料板一致。
⑷滅菌的離心管
⑸倒置顯微鏡
2．IBR Baitha—Nu/67弱毒株凍干毒，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，均由指定單位供應(yīng)。
3．細(xì)胞培養(yǎng)液
Eagles MEM 45％
0.5％水解乳蛋白－Earle液 45％
犢牛血清 10％
谷氨酰胺 0.03％
青、鏈霉素各200μg/ml
用7％NaHCO3液調(diào)pH6.8～7.0。
（二）操作方法
1．細(xì)胞制備 滅菌采取犢牛腎或睪丸，按常規(guī)胰蛋白酶消化法制備牛腎（BK）或睪丸（BT）細(xì)胞，置37℃溫箱培養(yǎng)，長(zhǎng)成良好單層細(xì)胞備用。一般使用次代細(xì)胞，但不超過4代。
2．病毒抗原制備 將IBR Baitha—Nu/67弱毒株凍干毒用LE（0.5％水解乳蛋白—Earle液）作10倍稀釋，取長(zhǎng)成良好的單層細(xì)胞（BK或BT），用Earle’s液洗一次后，按原培養(yǎng)液1／10的量接毒。置37℃溫箱吸附1h，然后加入pH7.1～7.2含青、鏈霉素200g/μgml的LE液至原培養(yǎng)液量，37℃培養(yǎng)，待80%～90％出現(xiàn)典型IBR病變時(shí)收獲培養(yǎng)物，凍融2次后，3 000r/min離心10min，其上清即為病毒抗原。測(cè)定病毒滴度（TCID）并分裝小瓶，貯于-70℃?zhèn)溆谩０肽陜?nèi)滴度保持不變。
3．病毒滴度測(cè)定 將制備的病毒抗原，用pH7.0～7.2的LE液作10倍遞增稀釋至10-7，每病毒稀釋滴度液接種細(xì)胞培養(yǎng)板4孔，每孔50μl，隨后每孔加入細(xì)胞懸液（50～60萬細(xì)胞／ml）10μl和細(xì)胞培養(yǎng)液50μl。設(shè)4孔細(xì)胞對(duì)照。用透明膠帶封板，置37℃培養(yǎng)。觀察1周，每天記錄細(xì)胞病變情況。
細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）的確定按Reed-Muench方法計(jì)算，即：
TCID50＝高于50％死亡率的病毒稀釋度的對(duì)數(shù) 距離比值×稀釋倍數(shù)（10）的對(duì)數(shù)。
4．無菌采集被檢血清，不加任何防腐劑。各種血清均56℃滅能30min。
5．將一瓶已知滴度IBR病毒抗原，用pH7.0～7.2的LE液稀釋成100TCID50／0.05ml，取0.3ml與等量的被檢血清于小試管中，37℃溫箱中和1h。
6．將已中和的被檢血清—病毒混合液加入培養(yǎng)板孔中，每個(gè)樣品接種4孔，每孔100ul。再于每一樣品孔中加入100μl細(xì)胞懸液，用透明膠帶封板，37℃培養(yǎng)。
7．每次試驗(yàn)時(shí)，均設(shè)立以下對(duì)照：
(1) 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 抗原，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清 抗原，其操作程序同試驗(yàn)組。
(2) 被檢血清毒性對(duì)照：每份被檢血清樣品接種2孔，每孔50μl，補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液50ml，再加細(xì)胞懸液100μl。
(3) 細(xì)胞對(duì)照：每孔加100μl細(xì)胞懸液，補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液100μl。
(4) 實(shí)際使用病毒抗原工作量的測(cè)定：將病毒抗原工作溶液（100TCID50／0.05μl）作10倍遞增稀釋至10-3，每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔50μl，補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液50μl，再加細(xì)胞懸液100μl。計(jì)算本次試驗(yàn)每0.05ml中TCID50的實(shí)際含量。
（三）結(jié)果判定
1．接種后72h判定結(jié)果 當(dāng)病毒抗原工作液對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照均出現(xiàn)典型細(xì)胞病變。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對(duì)照無細(xì)胞病變，被檢血清對(duì)細(xì)胞無毒性，細(xì)胞對(duì)照正常病毒抗原實(shí)際含量在30～300TCID50時(shí)，方能判定，否則被認(rèn)為無效。
2．判定標(biāo)準(zhǔn) 未經(jīng)稀釋的被檢血清能使50％或50％以上細(xì)胞孔不出現(xiàn)病變者判為陽性。