1.　原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。

　　2.　標記步驟：
　　(1)　稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
　　(2)　反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
　　(3)　將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
　　(4)　用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3?小時。
　　(5)　加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。
　　(6)　在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
　　(7)　3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
　　(8)　將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。

　　3.　結果判定：
　　(1)　定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選擇)。
　　(2)　定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。
　　酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
　　IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62

　　　　　　　　　酶量(mg／ml)　　 IgG量(mg／ml) 　　酶量
　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
　　　　　　　　　　40,000 　　　　　　160,000　　　IgG量

　　　(3)　本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質結合。