酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標記物中最常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。
　　(一)　酶制劑及其底物

　　凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學反應(yīng)的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：(1)來源方便，易于純化；(2)比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；(3)酶活性和量能用簡單方法測定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

　　由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH3～9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。

　　HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下:

　　　　　　　　　　　　　　　HRP

　　　　　　　　　DH2＋H2O2────→D＋2H2O

　　供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點不一。如DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點是能產(chǎn)生鮮艷的藍綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時間內(nèi)進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

　　由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時間反應(yīng)后呈色即達高峰（說明H２O２已消耗殆盡）。這樣即使再延長時間也不會增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。

　　(二)　HRP標記抗體的方法

　　酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。

　　戊二醛二步法

　　1.　原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。

　　2.　標記步驟：

　　(1)　稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。

　　(2)　反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。

　　(3)　將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

　　(4)　用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時。

　　(5)　加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。

　　(6)　在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。

　　(7)　3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

　　(8)　將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。

　　3.　結(jié)果判定：

　　(1)　定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統(tǒng)里)對酶結(jié)合物進行滴定( 見本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。

　　(2)　定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。

　　酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4

　　IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62

　　　　　　　　　酶量(mg／ml)　　 IgG量(mg／ml) 　　酶量
　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
　　　　　　　　　　40,000 　　　　　　160,000　　　IgG量

　　　(3)　本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。

　　4.　試劑及器材：

　　(1)　0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。

　　(2)　1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。

　　(3)　1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。

　　(4)　0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。

　　(5)　0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。

　　(6)　PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。

　　(7)　萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。

　　(8)　純化的特異性抗體或抗Ig抗體。

　　(9)　HRP(RZ>3.0)。

　　(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。

　　(11) 攪拌器，分光光度計，離心機。

　　(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。

　　簡易過碘酸鈉法

　　本法是以NaIO４先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標記抗體的產(chǎn)率高，將近70％的HRP和Ig結(jié)合，99％的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。

　　1.　原理：經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。

　　2.　標記步驟:

　　(1)　稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

　　(2)　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

　　(3)　將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。

　　(4)　加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。

　　(5)　加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混勻，再置4℃2小時。

　　(6)　將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過夜。

　　其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。

　　3.　結(jié)果判定：

　　除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。

　　IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

　　4.　試劑及器材:

　　(1)　0.1M NaIO４：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠，批號830602)溶于蒸餾水10ml中。

　　(2)　1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:

　　0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml

　　0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml

　　加蒸餾水至2,000ml。

　　(3)　0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:

　　　　　　　Na２CO３ 0.32克

　　　　　　　NaHCO３ 0.586克

　　　　　　　加蒸餾水至50ml

　　再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

　　(4)　NaBH４溶液(4mg／ml):

　　臨用時稱取NaBH４4mg溶于1ml蒸餾水中。

　　(5)　其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。

　　(三)　工作濃度的選擇

　　在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。

　　酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。

　　其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1％BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應(yīng)孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO４ 0.05ml終止反應(yīng)。

　　結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標，結(jié)合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。

　　有關(guān)試驗的試劑及器材均見ELISA部分。

　　要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實際應(yīng)用中的最適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統(tǒng)中，因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法)，以達到最適的實驗條件。

　　(四)　注意事項

　　1.　在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高,效價高(最低1∶16),純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件。

　　2.　所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，最好(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質(zhì))。否則，影響標記效果。

　　3.　室溫攪拌時須避光，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。

　　4.　濃的標記物相當穩(wěn)定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應(yīng)在12小時內(nèi)用完。切忌反復凍融。