動(dòng)物的選擇。常見的可以用來制備抗體的動(dòng)物有：小鼠(Mouse)、大鼠(Rat)、豚鼠(Guinea pig)、倉鼠(Hamster)、兔(Rabbit)、綿羊(Sheep)、山羊(Goat)、馬(Horse)、驢(Donkey)、奶牛(Cow)，還有的還用雞或者鴨的。選擇動(dòng)物無非就是考慮兩個(gè)問題，第一個(gè)問題是能否具有較好的免疫效果。特別是對(duì)于抗原是蛋白質(zhì)的情況，為了保證免疫成功，就要求宿主動(dòng)物與抗原來源物種之間需要有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，如果不太確定親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可以把抗原的序列與被免疫的動(dòng)物相應(yīng)的蛋白的序列進(jìn)行一個(gè)對(duì)比，優(yōu)先選擇同源性較低的物種進(jìn)行免疫。選擇動(dòng)物的第二個(gè)問題是抗血清產(chǎn)量的問題，其實(shí)很多情況下需要的血清量就很大程度上限制了選擇余地。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌�，抗血清的用量也有所不同。比如說只想做幾次Western Blot只需要一點(diǎn)點(diǎn)血清就夠了，此時(shí)就可以選用小鼠這樣的小動(dòng)物，而如果想生產(chǎn)二抗作為商業(yè)使用，則可選用羊、驢、馬這樣的大型動(dòng)物，大型動(dòng)物還可以進(jìn)行多次放血，以提高動(dòng)物的利用率。這里列幾種常見的物種以及它們的血清產(chǎn)量：

物種	抗血清產(chǎn)量(含血液中其它成份)
小鼠	每次可采0.1-0.2ml，每月可采兩次。也可以一次放血，產(chǎn)量約為1-1.5ml。
豚鼠	每次可采1-2ml，每月可采兩次。也可以一次放血，產(chǎn)量約為10-15ml。
兔	每次可采20ml，每月可采兩次。也可以一次放血，產(chǎn)量約為100ml。
山羊	每次可采血800ml，每月可采兩至三次。
馬	每次可采血3L，每月可采兩次。一年可以采10L以上。

如果是制備單克隆抗體，那選擇的余地就更小了，目前主流做單抗的動(dòng)物主要有小鼠、兔、大鼠。而且除了Epitomics公司外，其它單位是不可以制備兔單抗的(已申請(qǐng)專利)。另外需要指出的是，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都有相應(yīng)的法律法規(guī)，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前需要參考相應(yīng)的規(guī)定，只有獲得了相關(guān)的資質(zhì)才可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也由相應(yīng)的機(jī)構(gòu)繁殖和保種，選擇動(dòng)物應(yīng)該使用特定的動(dòng)物品系，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。

免疫佐劑(Adjuvant)。免疫佐劑主要有兩個(gè)作用：一是刺激機(jī)體引起免疫反應(yīng)，另一個(gè)作用是將抗原包起來延緩釋放，起到相當(dāng)于多次刺激的效果。可以用來制備抗體的免疫佐劑主要有這么幾類：鋁鹽、油乳、脂質(zhì)體、CpG、細(xì)胞因子、經(jīng)過處理的微生物或其代謝物。關(guān)于它們各自的特性我這里就不作詳細(xì)的介紹了，有興趣的可以看看這篇文獻(xiàn)：《我國免疫佐劑的研究進(jìn)展》(劉悅竹，2008)。目前應(yīng)用得比較廣泛的商品化佐劑主要有三種：弗氏佐劑(Freund's Adjuvant)、Ribi Adjuvant、Titermax。弗氏佐劑是應(yīng)用最多的佐劑，分為弗氏完全佐劑( Freund's Complet Adjuvant,FCA)和弗氏不完佐劑(Freund's Incomplete Adjuvant,FIA)， 弗氏完全佐劑由石蠟油和羊毛脂以及結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分組成，它是細(xì)胞免疫的刺激劑。弗氏不完全佐劑不含分枝桿菌，其它同弗氏完全佐劑。弗氏不完全佐劑僅能刺激體液免疫。通常在免疫動(dòng)物時(shí)，先使用弗氏完全佐劑進(jìn)行首次免疫，后用弗氏不完全佐劑作為加強(qiáng)免疫，二者使用前都需要與抗原進(jìn)行完全乳化。弗氏佐劑會(huì)引起動(dòng)物局部肉芽腫或者無菌性膿腫，人體接觸可能導(dǎo)致風(fēng)濕病，誤入眼睛可能造成失明，因此在操作時(shí)需要注意防護(hù)。

Ribi佐劑則采用可被代謝的角鯊烯代替礦物油，同時(shí)它也含有分枝桿菌的成份，與弗氏佐劑相比，它毒性小，可以減小動(dòng)物的局部接種反應(yīng)，但是同樣可以產(chǎn)生高親和力的抗體(抗原為蛋白質(zhì))。

Titermax不像弗氏佐劑和Ribi那樣是油包水的結(jié)構(gòu)，而是由角鯊烯和非離子型嵌段聚合物組成，此聚合物是由疏水性的聚氧丙烯和親水性的聚氧乙烯形成的異分子多聚體組成的。由于同時(shí)存在親水部分和疏水部分，故可以和抗原形成穩(wěn)定的乳濁液。Titermax毒性低，但是價(jià)格貴，而且對(duì)于弱免疫原性的抗原能否引起機(jī)體的免疫反應(yīng)尚存在爭議。

另外向大家推薦一款國產(chǎn)的佐劑，由北京康碧泉公司研制，商品名叫Quickantibody，此佐劑不含蛋白質(zhì)成分，而且免疫方式簡單，無需乳化抗原(只需要簡單混合即可免疫)，同時(shí)免疫周期短，抗原用量少，推薦大家使用。

佐劑和抗原的乳化 大部分佐劑在使用前都需要乳化，很多網(wǎng)友問起過乳化方法的問題，在這里我簡單地向大家介紹幾種我個(gè)人覺得比較好的方法吧。 先來了解一下怎么樣才算乳化好了。對(duì)于弗氏佐劑這類油包水結(jié)構(gòu)的佐劑來說，乳化完成后，可以取一滴乳化過的液滴滴在一杯清水里，看看此液滴是否分散，如果不分散則表明乳化完全，否則還要接著乳化。關(guān)于乳化的方法，比較好用的有三種：第一種比較費(fèi)時(shí)間，就是將抗原和佐劑放在EP管里，然后用槍反復(fù)吹打，然后放在渦旋儀上反復(fù)渦旋。第二種方法就是將抗原和佐劑用槍混合后放在超聲破碎儀下超聲，這個(gè)方法比較快速，但是需要一個(gè)配有小探頭的超聲破碎儀。第三種方法也就最簡單最常用的方法了：準(zhǔn)備好兩個(gè)玻璃注射器和一個(gè)魯爾接頭，將抗原和佐劑用槍在EP管內(nèi)混合好，然后吸入一個(gè)注射器內(nèi)，再用魯爾接頭將另一個(gè)注射器與它接上，把抗原和佐劑來回在兩個(gè)注射器內(nèi)推動(dòng)，兩分鐘左右就可以完成乳化工作。如果沒有魯爾接頭，也可以用一小截一次性輸液管將兩個(gè)注射器連接，不過有網(wǎng)友反映這個(gè)不是很好用。

免疫方案(1)免疫部位：常見的免疫部位有皮下、肌肉、腹腔、腳墊、靜脈、脾臟。大型動(dòng)物多為皮下或肌肉免疫，小型動(dòng)物可采用后面的免疫部位。制備多抗時(shí)，整個(gè)流程可采用同一種免疫部位，也可以多種部位聯(lián)合使用，但是初次免疫都建議在皮下進(jìn)行。在制備單抗時(shí)，甚至還可以將脾臟取出進(jìn)行體外免疫，脾臟免疫最大的優(yōu)勢(shì)就是可以大大減小免疫劑量并縮短周期，而且還可以解決高同源性蛋白無法免疫成功的問題。但體外免疫不能形成完整的免疫應(yīng)答反應(yīng)，抗體無法成熟，所產(chǎn)生的抗體全部為IgM，不能產(chǎn)生其它類型的抗體。對(duì)體外免疫感興趣的朋友可以看看這篇文獻(xiàn)：《體外免疫法制備單克隆抗體的研究》(陸芹章，1994)。(2)免疫形式。抗原通常需要與佐劑混合充分后才進(jìn)行免疫，也有改進(jìn)不用佐劑的方法，比如可以將抗原跑SDS-PAGE膠，然后將膠進(jìn)行磨碎充分即可進(jìn)行免疫，這樣可以將抗原(蛋白質(zhì)類抗原)純化，而且還可以延緩抗原的釋放。也有人將抗原從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到NC膜上或者PVDF膜上然后將其磨碎進(jìn)行免疫，還有人將抗原連接到瓊脂顆粒等固相載體上，這樣可以增加抗原的顆粒化程度，也可以增大抗原與機(jī)體免疫應(yīng)答系統(tǒng)的接觸。(3)免疫劑量。免疫劑量根據(jù)被免疫的動(dòng)物、免疫部位以及抗原的本身的特性相差很遠(yuǎn)。如果用兔制備多抗，首次免疫(皮下)一般在200-1000ug之間，對(duì)于大鼠，首次免疫(皮下)為100-500ug，對(duì)于小鼠， 首次免疫(皮下)一般在10-100ug之間，加強(qiáng)免疫一般為首次免疫劑量的20%-50%。尾靜脈或脾內(nèi)方式加強(qiáng)則可減至幾微克至十微克。對(duì)于體型比較大的動(dòng)物可酌量增加(不能按照體重比增加)，具體的用量請(qǐng)大家參考文獻(xiàn)。 (4)免疫周期。首次免疫后，一般在10-15d左右抗體的產(chǎn)量會(huì)達(dá)到一個(gè)峰值，但是此時(shí)抗體親和力不夠，大部分都是IGM，因此需要進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫一般在首次免疫后三至四周進(jìn)行。第二次、第三次加強(qiáng)免疫間隔可以縮短至2-3周。這個(gè)時(shí)間不太能長也不能太短，太短起不到加強(qiáng)的效果，而且還容易引起免疫耐受，如果相隔太久，則前面的免疫將失去初步刺激的效果。如果是采用脾內(nèi)免疫，則可以在一定程序上縮短免疫周期。