將抗原結(jié)合到抗體微珠基質(zhì)上的最簡(jiǎn)單方法是將微珠裝到一個(gè)層析柱內(nèi)，將抗原溶液流經(jīng)層析柱，當(dāng)抗原流經(jīng)層析柱時(shí)結(jié)合到抗體上而被固定，直到洗脫時(shí)才洗脫下來(lái)。這種方法的效率是根據(jù)抗原與固定的抗體之間的接觸時(shí)間決定的，所以抗原抗體之間的作用時(shí)間可以用低流速而延長(zhǎng)。

1．準(zhǔn)備工作

開(kāi)始前，要考慮層析柱的類(lèi)型和大小選擇微珠。如果微珠的柱床體積寬和淺比窄和高的柱床洗脫出來(lái)的峰尖，而且這樣較容易將微珠移到另一個(gè)容器中儲(chǔ)存。太寬的層析柱的缺點(diǎn)是當(dāng)改變洗脫緩沖液時(shí)微珠易擴(kuò)散。

2．所需溶液和特殊設(shè)備

PBS；

簡(jiǎn)單的層析裝置。

3．操作步驟

（1）將抗體微珠轉(zhuǎn)移到一個(gè)合適的層析柱中，用20倍柱床體積的PBS洗脫。

（2）將抗原溶液加到層析柱中，讓溶液以一個(gè)較緩慢的速度（約lml／hr每毫升柱床體積），可以用一個(gè)泵控制流速。

（3）用20倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗滌層析柱。

此層析柱可用于進(jìn)一步洗滌或洗脫。

4．常見(jiàn)問(wèn)題

這種方法最大一個(gè)問(wèn)題就是某些蛋白非特異性結(jié)合到分離柱上，這些蛋白可以出現(xiàn)在洗脫液中，從而使純化效率降低。基質(zhì)本身和抗體基質(zhì)復(fù)合物具有與待檢抗原溶液中蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的表面活性。雖然這些反應(yīng)較正常的抗原—抗體反應(yīng)要弱得多，但抗原溶液中如存在大量額外的非特異性蛋白即意味著在此過(guò)程中將產(chǎn)生內(nèi)在的高本底。為了盡可能減少非特異性吸附，可以采取以下幾種措施。

首先，如采用各種親和柱純化法，所用基質(zhì)的量須調(diào)整到略高于其飽和水平。保持抗體—微珠—基質(zhì)的體積，使非特異性本底盡可能降低。捕獲大量抗原所需抗體—微珠基質(zhì)的量與流速有關(guān)。流速較慢時(shí)，柱容量更有效，因?yàn)榕悸?lián)的抗體就有更多時(shí)間與抗原結(jié)合。

第二種方案是降低柱上的非特異性吸附量。許多吸附到柱基質(zhì)上的蛋白質(zhì)是部分或全部變性的蛋白。當(dāng)制備抗原溶液時(shí)，機(jī)械性壓力應(yīng)盡可能小，并避免過(guò)度與空氣接觸。降低抗體柱上非特異結(jié)合的一種較好的方法是將抗原溶液通過(guò)一個(gè)未與抗體偶聯(lián)的瓊脂糖柱，此層析柱應(yīng)與抗體—微珠基質(zhì)柱體積相同或更大。另外一種引起非特異性結(jié)合的因素來(lái)自小顆粒碎片被阻留在柱基質(zhì)上。將抗原溶液經(jīng)過(guò)100 000g離心30min，可以去除制品中大多數(shù)較大的凝聚物。

第三種降低本底的方法是用緩沖液洗滌層析柱以去除非特異性蛋白。任何不干擾抗原抗體反應(yīng)的緩沖液都可以用于阻止非特異性結(jié)合。