雙抗：青霉素100u/ml; 鏈霉素100μl/ml

PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸餾水中加入上述質量物質，用鹽酸調節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存。

 

2.　原代血管內皮細胞的獲取與培養(yǎng)　按Jaffe等人〔1〕的方法加以改進。在無菌條件下取新生兒臍帶，剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分，找到臍靜脈。一端插上帶有膠管的玻璃管結扎固定，經膠管接注射器，用生理鹽水灌洗。待臍靜脈內的殘血除凈后，用37℃ PBS，沖洗兩次，將另一端用鐵夾夾閉，向臍靜脈內灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml，夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期間經常翻動臍帶使酶溶液在血管內流動以促使內皮細胞均勻與酶接觸。取出臍帶后輕輕擠壓管壁，將含有內皮細胞的胰蛋白酶注入50ml錐形離心管中，加入小牛血清2ml終止酶反應。再以30ml PBS沖洗管腔，流出液一并入離心管，1000r/min離心10min，棄上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM（Dibco）？]培養(yǎng)液，充分混合制成細胞懸液。取0.1ml細胞懸液在血細胞計數板計數。最后調細胞數，以1×105/ml接種至24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃靜止培養(yǎng)24h更換培養(yǎng)液，以除去未貼壁的細胞。以后每隔2d換液1次，以維持細胞的營養(yǎng)和內環(huán)境的穩(wěn)定。

胰蛋白酶溶液（100ml）配制：1）將D-Hanks（橙紅色）液高壓消毒滅菌，用NaHCO3液調節(jié)pH至7.2左右。 2）稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許消毒的鹽溶液調成糊狀，然后再補足鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱內 ，并不時攪拌振蕩。 3）次日先用濾紙粗慮，再過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱或－20℃保存?zhèn)溆茫�常用濃度�?.25％或0.125％；胰蛋白酶溶液（深紅色）偏酸，使用前用NaHCO3調pH至7.2左右。

D－Hanks液配制：

KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L,

Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚紅 0.02 g/L

 

3． 傳代內皮細胞的培養(yǎng)　原代內皮細胞融合后用培養(yǎng)液沖洗兩次，然后用0.25%胰酶加入到內皮細胞中，每孔0.3ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細胞皺縮、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養(yǎng)液，吸管吹打，制成細胞懸液，計數后按105個細胞/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。

 

4．血管內皮細胞的鑒定 　1）倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)特點。2）VWF相關抗原免疫熒光檢查：在24孔塑料培養(yǎng)板孔內放置無菌的蓋玻片0.5cm×0.6cm，每孔中種植1ml含有105個細胞的原代或傳代內皮細胞懸液。待內皮細胞生長至近融合狀態(tài)時，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，投入冷丙酮中（-18～-20℃），細胞面向上，作用7min，用PBS沖洗3次，每次1min，而后進行間接免疫熒光檢查，第一抗體為鼠抗人VWF單克隆抗體，1∶20倍稀釋，加入50μl于蓋玻片上，放入濕盒內4℃ 。同時不加一抗做陰性對照。用PBS沖洗3次后，加入異硫氫酸標記的二抗50μl，放入37℃2h后，用PBS洗滌3次。然后立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。 血管內皮細胞鑒定結果：　VWF相關抗原間接免疫熒光檢查，原代及傳代培養(yǎng)的內皮細胞漿中有黃綠色的熒光著色，胞核呈黑綠色，整個細胞輪廓清楚。作為對照的內皮細胞片子中，偶見綠色斑點散發(fā)熒光，未見細胞輪廓。

 

5． 內皮細胞體外生長情況　 用胰蛋白酶消化的人臍靜脈內皮細胞，接種在24孔塑料培養(yǎng)板各孔內4h后，大部分細胞貼壁。早期細胞呈小多角、球形、呈團狀，少數細胞伸展，48～72h生長最快，逐漸生長成梭形，有些細胞排列呈魚貫狀相連，間有旋禍狀排列。核清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相多見，1～2核仁，胞漿豐富，內含小顆粒。于3～4d后融合，7～10d胞體呈多角形，相互嵌合，為單層呈鋪路石狀排列。