—免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法

 

1 范圍

     本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了免疫親和層析凈化—高效液相色譜法和免疫親和層析凈化—熒光光度法測(cè)定食品中黃曲霉毒素的條件和詳細(xì)分析步驟。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米、花生及其制品（花生醬、花生仁、花生米）、大米、小麥、植物油脂、醬油、食醋等食品中黃曲霉毒素的測(cè)定。

樣品中黃曲霉毒素的檢出限：免疫親和層析凈化—高效液相色譜法和免疫親和層析凈化—熒光光度法為1mg/kg；免疫親和層析凈化—熒光光度法測(cè)定醬油樣品中黃曲霉毒素檢出限為2.5mg/kg。

 

2 免疫親和層析凈化高效液相色譜法

2.1 方法提要

    試樣經(jīng)過(guò)甲醇-水提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫/PBS將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過(guò)免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過(guò)帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測(cè)定黃曲霉毒素的含量。

 

2.2 試劑和溶液

    除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭�、重蒸餾水。

2.2.1甲醇（CH3OH）：色譜純

2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

2.2.5 苯：色譜純

2.2.6乙腈：色譜純

2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

2.2.8氯化鈉（NaCl）

2.2.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

2.2.10磷酸二氫鉀（KH2PO4）

GB/T 18979-2003

 

2.2.11氯化鉀（KCl）

2.2.12  PBS緩沖溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。

2.2.13  吐溫-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000mL。

2.2.14  pH7.0磷酸鹽緩沖溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氫鉀溶液與29.1mL 0.1mol/L的氫氧化鈉溶液混勻后，稀釋到100 mL。

2.2.15 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2）：純度≥99%。

2.2.16 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：用苯-乙腈（98+2）溶液分別配制0.100mg/mL的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)貯備液，保存于4ºC備用。

2.2.17 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取適量的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用苯-乙腈（98+2）溶液稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2.18 柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）：稱取0.1g碘，溶解于20mL甲醇后，加純水定容至200mL，以0.45μm的尼龍濾膜過(guò)濾，4℃避光保存。

 

2.3 儀器和設(shè)備

    實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器、設(shè)備、材料及下列各項(xiàng)。

2.3.1 高速均質(zhì)器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.2 黃曲霉毒素免疫親和柱。

2.3.3 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。

2.3.4 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.5 玻璃試管：直徑12 mm ，長(zhǎng)75mm，無(wú)熒光特性。

2.3.6 高效液相色譜儀：具有360nm激發(fā)波長(zhǎng)和大于420nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)器。

2.3.7 空氣壓力泵。

2.3.8 微量注射器：100mL。

2.3.9 色譜柱：C18柱（柱長(zhǎng)150 mm ，內(nèi)徑4.6mm，填料直徑5mm）。

 

2.4 分析步驟

2.4.1提取

2.4.1.1大米、玉米、小麥、花生及其制品：準(zhǔn)確稱取經(jīng)過(guò)磨細(xì)（粒度小于2mm）的試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準(zhǔn)確加入125.0mL（ ）甲醇-水（7+3），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取15.0mL（ ）濾液并加入30.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾1~2次，至濾液澄清，備用。

2.4.1.2 植物油脂：準(zhǔn)確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及加入甲醇-水（7+3）至125.0mL（ ），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取15.0mL（ ）濾液并加入30.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾1~2次，至濾液澄清，備用。

2.4.1.3 醬油：稱取試樣50.0g于250.0mL具塞錐形瓶中，加入2.5g氯化鈉及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL（ ），以均質(zhì)器高速攪拌提取1min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取10.0mL（ ）濾液并加入40.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾1~2次，至濾液澄清，備用。

2.4.1.4 食醋：準(zhǔn)確稱取5.0g樣品，加入1.0g氯化鈉，以pH7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25.0mL（ ），混勻，定量濾紙過(guò)濾。取10.0mL（ ）濾液加入10.0mL（ ）緩沖液，混勻。以玻璃纖維濾紙過(guò)濾1~2 次，至濾液澄清，備用。

2.4.2 凈化

2.4.2.1 大米、玉米、小麥、花生及其制品、植物油脂： 將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取15.0mL（ ）樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過(guò)柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL（ ）色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。

2.4.2.2 醬油： 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10mL（ ）醬油樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱。用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL（ ）色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。

2.4.2.3食醋： 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL（ ）食醋樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，用10mL 0.1%的吐溫/PBS溶液清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL（ ）色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。

2.4.3測(cè)定

2.4.3.1    高效液相色譜條件

流動(dòng)相：甲醇-水（45+55）

流速：0.8mL/min

柱后衍生化系統(tǒng)

衍生溶液：0.05%碘溶液

衍生溶液流速：0.2mL/min

反應(yīng)管溫度：70°C

反應(yīng)時(shí)間：1min

2.4.3.2    定量

用進(jìn)樣器吸取100mL黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液（2.2.17）注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值（峰高或峰面積），得到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖。參考譜圖見圖1。

   

 

 

圖1  黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2的標(biāo)準(zhǔn)譜圖

 

取樣品洗脫液1.0mL加入重蒸餾水定容至2.0mL，用進(jìn)樣器吸取100mL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定試樣的響應(yīng)值（峰高或峰面積）。經(jīng)過(guò)與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液譜圖比較響應(yīng)值得到試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的濃度 。

2.4.4 空白試驗(yàn)

    用水代替試樣，按2.4.1~2.4.3步驟做空白試驗(yàn)。

2.4.5 結(jié)果計(jì)算

檢測(cè)結(jié)果按公式（1）計(jì)算：

                        …………（1）

      

式中： — 試樣中黃曲霉毒素（B1、B2、G1或G2）的含量，mg/kg；

      — 試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 空白試驗(yàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 最終甲醇洗脫液體積，mL；

      — 最終凈化洗脫液所含的試樣質(zhì)量，g；

      — 試樣稱取量，g；

      — 樣品和提取液總體積，mL；

      — 稀釋用樣品濾液體積，mL；

      — 稀釋液體積，mL；

      — 通過(guò)親和柱的樣品提取液體積，mL。

    黃曲霉毒素總量為B1、B2、G1、G2個(gè)別濃度之和，即B1+B2+G1+G2。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。

計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后2位。

 

3 免疫親和層析凈化熒光光度法

3.1 方法提要

試樣經(jīng)過(guò)甲醇-水提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用蒸餾水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過(guò)免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度。洗脫液通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）總量。

3.2 試劑和溶液

3.2.1甲醇（CH3OH）：色譜純

3.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

3.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

3.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

3.2.5 苯：色譜純         不要去掉

3.2.6乙腈：色譜純

3.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

3.2.8氯化鈉（NaCl）

3.2.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

3.2.10磷酸二氫鉀（KH2PO4）

3.2.11氯化鉀（KCl）

3.2.12  溴溶液儲(chǔ)備液（0.01%）：稱取適量溴，溶于水，配成0.01%的儲(chǔ)備液，4℃避光保存。

3.2.13  溴溶液工作液（0.002%）：取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL水混勻，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩Ｐ杳看问褂们芭渲啤?/div>