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耶爾森氏菌及檢驗(yàn)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-05-11
核心提示:   耶爾森氏菌屬包括11個(gè)種,其中對人有致病性的有三種:小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核菌和鼠疫菌。只有小腸結(jié)腸炎耶爾

  耶爾森氏菌屬包括11個(gè)種,其中對人有致病性的有三種:小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核菌和鼠疫菌。只有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和假結(jié)核菌已確定是食源性病原體。鼠疫耶爾森氏菌引起黑疽病,不通過食品傳染。

  1981年根據(jù)DNA以及生化和形態(tài)特征的相關(guān)資料,與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌極為密切3個(gè)同源群被作為耶爾森氏菌的新種命名,它們是弗氏耶爾森氏菌(Y·frederiksenii)、中間型耶爾森氏菌(Y·intermedia)和克氏耶爾森氏菌(Y·krislensenii)。

一、生物學(xué)特性

1、形態(tài)特性

  本菌為革蘭氏陰性桿菌或球桿菌,大小為1-3.5×0.5-1.3μm,多單個(gè)散在,有時(shí)排列成短鏈或成堆。本菌不形成芽胞,無莢膜,有周鞭毛;但其鞭毛在30℃以下培養(yǎng)條件形成,溫度較高時(shí)即喪失,因此表現(xiàn)為30℃以下有動(dòng)力,而35℃以上則無動(dòng)力。

2、培養(yǎng)特性

  本菌生長溫度為30-37℃,但在22-29℃才能使本菌的某些特性出現(xiàn)。4℃時(shí)能保存和繁殖。本菌世代時(shí)間長,最短亦需40分鐘左右。在SS或麥康凱瓊脂上于25℃經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng),菌落細(xì)小,至48小時(shí)直徑才增大成0.5-3.0mm。菌落圓整、光滑、濕潤、扁平或稍隆起,透明或半透明;在麥康凱瓊脂上菌落淡黃色,如若微帶紅色,則菌落中心的紅色常稍深。本菌在肉湯中生長呈均勻混濁,一般不形成菌膜。

3、生化特性

表一:本菌的生化特性及其與近緣菌的鑒別

應(yīng)

耶氏菌

假結(jié)核耶氏菌

小腸結(jié)腸炎耶氏菌

中間型耶氏菌

費(fèi)

耶氏菌

耶氏菌

賴氨酸

-

-

-

-

-

-

精氨酸

-

-

-

-

-

-

鳥氨酸

-

-

+

+

+

+

動(dòng)力(22-26)

-

+

+

+

+

+

動(dòng)力(35-37)

-

-

-

-

-

-

尿

-

+

+

+

+

+

苯丙氨酸

脫氨基酶

-

-

-

-

-

-

甘露醇

+

+

+

+

+

+

山梨醇

+/-

-

+

+

+

+

纖維二糖

-

-

+

+

+

+

核糖醇

-

-

-

-

-

-

-

-

+/-

+/-

+/-

+/-

-

-

+

+

+

-

鼠李糖

-

+

-

+

+

-

棉子糖

-

+/-

-

+

-

-

蜜二糖

-

+/-

-

+

-

-

枸櫞酸鹽

-

-

-

+/-

+/-

-

V-P

-

-

+/-

+

+

-

-

-

+/-

+

+

+/-

水楊甙

+/-

+/-

+/-

+

+

-/+

七葉甙

+

+

+/-

+

+

-

-

-

+/-

+/-

+/-

+/-

吡嗪酰胺酶

-

-

+/-

+

+

+

4、生物型

  小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的生物型分類方法有幾種,目前FDA細(xì)菌分析手冊第八版中采用的是Wanters 1981的分型方法。

 

表二:小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的生物型

生化測試

應(yīng)

1A

1B

2

3

4

5

6

+

+

-

-

-

-

-

七葉甙/水楊甙

(24h)

+/-

-

-

-

-

-

-

+

+

(+)

-

-

-

-

+

+

+

+

-

V

+

海藻糖

+

+

+

+

+

-

+

吡嗪酰胺酶

+

-

-

-

-

-

+

β-D葡糖甙酶

+

-

-

-

-

-

-

V-P

+

+

+

+/-c

+

(+)

-

注:( ) 表示遲緩反應(yīng)

V 表示可變反應(yīng)

C 在日本發(fā)現(xiàn)血清型為0:3的生物型

5、血清型

  小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌株根據(jù)其耐熱性和耐受高壓滅菌的菌體抗原能被血清學(xué)分型。Wanters將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和相關(guān)菌歸納為54個(gè)血清群,Aleksii和Bockemuh等人提議將小腸耶氏菌的血清群簡化為18個(gè)群。目前下列血清群的致病菌株已通過鑒定,它們是0:1,2a,3;0:2a,3;0:3;0:8;0:9;0:4,32;0:5,27;0:12,25;0:13a,13b;0:19;0:20;0:21。引起人類疾病的主要血清群是0:3,0:8,0:9和0:5,27。

二、流行病學(xué)

1、細(xì)菌分布

  小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分布很廣,可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉類、豆制品、沙拉、牡蠣、哈和蝦。也存在于環(huán)境中,如湖泊、河流、土壤和植被。已從家畜、狗、貓、山羊、灰鼠、水貂和靈長類動(dòng)物的糞便中分離出該菌。在港灣周圍,許多鳥類包括水禽和海鷗可能是帶菌者。

  豬的帶菌率較高,日本報(bào)告檢出率為4%,加拿大為3.6%,丹麥為10-17%。在豬中,該菌最易在扁桃腺中發(fā)現(xiàn)。

2、流行情況

  確定耶爾森氏菌作為一種食源性疾病的有關(guān)特性了解較多,其在世界范圍內(nèi)已爆發(fā)多起,食品和飲水受到污染,往往是爆發(fā)胃腸炎的重要原因。七十年代在加拿大魁北克地區(qū)暴發(fā)過兩起,有138名兒童感染,源于攝入生牛奶。1976年在美國紐約爆發(fā)過一起,有217名學(xué)生感染,在這起發(fā)病過程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。1980年發(fā)生于華盛頓的一起有87人感染,污染源是用未經(jīng)氯處理的泉水做的豆腐。由本菌引起的胃腸炎或中毒爆發(fā),在歐洲以冬春季節(jié)較多,夏季較少,而日本則以夏季發(fā)病率較高。在我國福建省南部地區(qū),該菌是冬春季腹瀉的重要病原菌,根據(jù)陳元川案(1984)于不同季節(jié)對豬帶菌動(dòng)態(tài)的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)養(yǎng)豬場僅在冬春兩季有該菌檢出,檢出的菌株均為O3血清型。

3、臨床癥狀

  小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是30年代引起注意的急性胃腸炎型食物中毒的病原菌,為人畜共患病。潛伏期約攝食后3-7天,也有報(bào)導(dǎo)11天才發(fā)病。病程一般為1-3天,但有些病例持續(xù)5-14天或更長。主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、嘔吐、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等。耶爾森氏菌病典型癥狀常為胃腸炎癥狀、發(fā)熱、亦可引起闌尾炎。有的引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎,另一個(gè)并發(fā)癥是敗血癥,即血液系統(tǒng)感染,盡管較少見,但死亡率較高。

  本菌對易染人群為嬰幼兒,常引起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉。

三、致病性

1、腸毒素

  該菌能產(chǎn)生耐熱性腸毒素,(分子量為10000-50000),能耐熱121℃30分鐘,能在4℃保存7個(gè)月,pH1-11中穩(wěn)定。但腸毒素的產(chǎn)生僅限于22-25℃。血清型03、08和09幾乎經(jīng)常產(chǎn)生腸毒素,在其他血清型中也有產(chǎn)生腸毒素的菌株。該腸毒素被攝入即可引起發(fā)病。

2、侵襲性

  Hela細(xì)胞感染,血清型O1、O3、O4、O5B、O8、O9、O15、O18、O20、O21和O22都能侵入Hela細(xì)胞,鑒于Hela細(xì)胞感染陽性株多是人類致病的常見血清型,以及從人和動(dòng)物死亡所見腸類的侵入模型,表明Hela細(xì)胞侵入性在小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌腹瀉的發(fā)病機(jī)理上是重要的。

  Sereny試驗(yàn),有人將11株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的菌懸液接種于豚鼠眼結(jié)膜,有6株引起嚴(yán)重的角膜結(jié)膜炎,即Sereny試驗(yàn)陽性。這6株均為O8血清型。

3、自凝性。

  1980年Laird等人提出了一種測定本菌毒力的簡易方法,即將試驗(yàn)菌接種于二管含10%小牛血清的組織培養(yǎng)液內(nèi),分別置22℃和36+1℃培養(yǎng),若22℃培養(yǎng),菌液混濁,而37℃培養(yǎng),細(xì)菌凝結(jié),上層液體透明,即為有毒力的菌株,稱為自凝陽性。在檢查的180株菌中有25株陽性,這些陽性菌株均能引起腹瀉。

4、VW抗原

  已知該菌的某些菌株具有與鼠疫耶爾森氏菌和假結(jié)核耶爾森氏菌在免疫學(xué)上相同的VW抗原。其在37℃生長時(shí)需要鈣而在25℃生長時(shí)不需要鈣的菌株即含VW抗原。Karmali等人將從病人糞便檢出的O21血清型自凝陽性的菌株,在草酸鎂瓊脂上于35℃培養(yǎng)不生長,用于口服小鼠則產(chǎn)生腹瀉。可見自凝陽性與缺鈣培養(yǎng)基上35℃無生長能力是一致的,能使小鼠發(fā)生腹瀉。

5、毒性質(zhì)粒。

  耶氏菌病和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌帶有41-48Mdal的質(zhì)粒有關(guān)。這被認(rèn)為是毒性質(zhì)粒,即與毒力有關(guān)的質(zhì)粒。有人將失去毒性質(zhì)粒的O8、O3和O9型菌株用小鼠作喂飼試驗(yàn),均不發(fā)病,但用帶毒性質(zhì)粒的O8和O3型菌株試驗(yàn)時(shí),小鼠則均發(fā)生腹瀉或死亡。且菌株自凝試驗(yàn)的結(jié)果與毒性質(zhì)粒的存在與否相一致。

四、檢驗(yàn)與控制

A、增菌

  1、無菌稱取25.0g樣品于225mL,蛋白胨山梨醇膽汁肉湯(PSBB)中,均質(zhì)30秒,置10℃培養(yǎng)10天。

  2、如果懷疑產(chǎn)品為高含量耶氏菌,在肉湯培養(yǎng)前各取0.1mL劃線于麥康凱瓊脂和cefsulodin�irgasan�新生霉素(CIN)瓊脂。然后取1mL均質(zhì)液至9mL 0.5%鹽水(含0.5%KOH)中,混合數(shù)秒鐘,各取0.1mL 劃線麥康凱和CIN瓊脂平板。將平板置30℃培養(yǎng)1天,把平板上生長的菌落轉(zhuǎn)移到Whatmam541濾紙上,用于DNA克隆雜交技術(shù)直接檢測耶氏菌的致病基因。如果耶氏菌含量較低,省去這一步。

  3、將經(jīng)10天培養(yǎng)的增菌肉湯充分混合,轉(zhuǎn)移0.1mL至1mL 0.5%鹽水(含0.5%KOH)中,混合5-10秒。連續(xù)劃線于麥康凱平板和CIN平板。另取0.1mL增菌液至1mL 0.5%鹽水中,如上在劃線前混合5-10秒。置平板于30℃培養(yǎng)1天。

B、細(xì)菌分離。

  檢查經(jīng)1天培養(yǎng)的麥康凱平板,排除紅色或粘液狀菌落,挑取小的(直徑1-2mm),偏平,無色的或淡粉紅色菌落。同時(shí)檢查CIN平板,挑取具有緊紅色中心整個(gè)邊緣明顯無色的小菌落(直徑1-2mm)。用接種針將所選菌落穿刺接種于賴氨酸精氨酸鐵瓊脂(LAIA)斜面。Christensen�s尿素瓊脂平板或斜面。膽汁七葉甙瓊脂平板或斜面。室溫培養(yǎng)48小時(shí)。在LAIA中的培養(yǎng)物會產(chǎn)生鹼性斜面,酸性底層,不產(chǎn)生氣體和H2S(KA--)的反應(yīng),被認(rèn)為是尿素酶陽性的可疑耶氏菌。去除在LAIA中產(chǎn)H2S或產(chǎn)氣或尿素酶陰性的培養(yǎng)物。

C、鑒定

  將LAIA斜面上的培養(yǎng)物劃線接種于厭氧卵黃瓊脂(AEY),置室溫培養(yǎng)。使用AEY上的生長物進(jìn)行純度檢查、脂肪酶反應(yīng)(2-5天)氧化酶試驗(yàn)、革蘭氏染色、和生化試驗(yàn)的接種。將AEY上的菌落接種于生化試驗(yàn)培養(yǎng)基,置室溫培養(yǎng)3天(動(dòng)力試驗(yàn)培養(yǎng)基和MR-VP肉湯在35-37℃培養(yǎng)1天)。

D、解釋

  耶爾森氏菌為氧化酶陰性、革蘭氏陰性的桿菌,表1和表2可用于鑒定耶氏菌的菌株和生物型。目前已知小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生物型為1B、2、3、4、5具有致病性,這些生物型和第6生物型以及克氏耶氏菌不能快速水介七葉甙和發(fā)酵水楊甙。生物型6和克氏耶氏菌相當(dāng)少,可以通過微弱發(fā)酵蔗糖加以區(qū)別,并且吡嗪酰胺酶均為陽性反應(yīng)。對于生物型1B、2、3、4、5的小腸結(jié)腸炎耶氏菌可進(jìn)一步進(jìn)行致病性測試。

  耶爾森氏菌為兼性厭氧菌,生長溫度為-1�48℃,能在反復(fù)冷凍,緩化下存活。由于該菌可在4℃下進(jìn)行冷增菌,因此保存在4-5℃冰箱中的食品具有污染的危險(xiǎn)。該菌要求較高的水活度,最低水活度為0.95,pH接近中性,較低的耐鹽性。對加熱、消毒劑敏感。

  控制耶爾森氏菌的關(guān)鍵因素包括適當(dāng)?shù)恼糁蠡虬褪蠝缇m宜的食品處理以防止二次污染。進(jìn)行水處理、合理使用消毒劑等控制措施。

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