革蘭氏染色是細菌鑒別染色方法中最常使用的，染色結果可區分革蘭氏陽性菌及陰性菌，是鑒定細菌最重要的分類依據之一。

初染劑：結晶紫，步驟中最先使用的試劑，把細菌染成藍紫色。

媒染劑：革蘭氏碘液，可與初染劑結合，形成結晶紫及碘復合物(CV-I)，加強染料顏色的固定。

脫色劑：95%乙醇，因陽性菌與陰性菌細胞壁構造不同，而有不同的脫色反應。

復染劑：番紅，被上述步驟脫色的細菌，就會被這此試劑染成紅色。

革蘭氏染色法是由丹麥微生物學家漢斯-克理斯蒂安-革蘭(Hans Christian Gram)于1884年發明，至今仍為鑒別細菌之最重要方法。依據革蘭氏染色法可將細菌分為革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性兩類。其染色原理推測與此兩類細菌之細胞壁結構有重大關系。

其一為：革蘭氏陰性細菌的細胞壁含脂量高，酒精脫色時會將部份脂質萃取出來，而使細胞壁結構松動，通透性增加，故結晶紫-碘復合體(CV-I)被帶出細菌體外而無色。革蘭氏陽性細菌的細胞壁幾乎不含脂質，酒精甚至會使細胞壁脫水，故結構更加致密，結晶紫-碘復合體就被留在細菌體內。

其二為：酒精處理時，會使細菌的細胞壁肽聚醣(peptidoglycan)空隙縮小。革蘭氏陽性細菌之細胞壁肽聚醣較厚，而革蘭氏陰性細菌較薄，所以造成結晶紫-碘復合體離開革蘭氏陰性細菌的機會較大。故以酒精脫色后，取用紅色的番紅進行復染，此時無色的革蘭氏陰性細菌就會變成粉紅色，而原本已染上藍色的革蘭氏陽性細菌就會變成紫色。

不論何種染色法，最基本都要先熟習抹片的制作，抹片應厚薄適中，且宜勻而薄，細菌量不宜太多

染色時，脫色步驟可影響結果正確與否，脫色過度會使初染劑流失，使革蘭氏陽性細菌變為革蘭氏陰性細菌的顏色：但脫色不足，則無法完全去除CV-I復合物，結果使革蘭氏陰性細菌呈現革蘭氏陽性細菌的顏色。此步驟非常需要經驗的累積。

每種染劑之間，以蒸餾水或無菌水充分清洗，以除去剩余的染液。

宜使用18-24小時培養的新鮮菌落，因老化的細菌易失去保留初染劑的能力，而顯示出錯誤的結果，可能部分染成紅色，部分呈紫色。

建議每次染色時，可以帶品管玻片一起染色，確定染色時間及步驟正確。