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磷酸鹽緩沖稀釋液
貯存液：
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 34.0g
蒸餾水 500mL
用大約175 mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2（圖1-1、1-2），用蒸餾水稀釋至1000 mL后貯存于冰箱。
稀釋液：用蒸餾水稀釋1.25mL貯存液至1000mL,分裝于合適容器,121℃高壓滅菌15min。
2. 培養(yǎng)基制作
① 計(jì)算出所需數(shù)量，用電子稱、稱量紙、藥勺來(lái)稱取。
② 放入比所用蒸餾水大的燒瓶中，使之充分混勻于蒸餾水后加熱溶解并煮沸。
※ 備注：即使是同一培養(yǎng)基，各個(gè)廠家的配制方法多少有些不同，所以一定要充分參照培養(yǎng)基上的說(shuō)明。
2.1 傾注培養(yǎng)培養(yǎng)基：
● 平板計(jì)數(shù)瓊脂等：高壓滅菌后保存，使用時(shí)加溫溶解。
● 去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基：使用時(shí)將培養(yǎng)基粉末加溫溶解。
※ 備注：傾注培養(yǎng)時(shí)，向培養(yǎng)基分注的步驟參照下述的注意事項(xiàng)
①樣液稀釋以及從接種到培養(yǎng)基混合完畢，最好在15分鐘以內(nèi)完成。
②每個(gè)平皿的分注量約15-20ml。分注后將平皿傾斜和旋轉(zhuǎn)使之充分混合，但要注意不要讓培養(yǎng)基從平皿內(nèi)溢出，且不要粘附在平皿壁和蓋上。
③分注時(shí)三角燒瓶掛有培養(yǎng)基滴時(shí)，下一次分注的培養(yǎng)基可能被燒瓶外壁的細(xì)菌污染，所以要用酒精棉擦拭，再將瓶口用火焰滅菌。
2.2 平板培養(yǎng)基：
平板培養(yǎng)基是將溶解后的培養(yǎng)基分注15-20ml到無(wú)菌平皿里，使之凝固。
●TCBS瓊脂培養(yǎng)基、DHL瓊脂培養(yǎng)基：加溫溶解后，分注、凝固、干燥表面。為了防止沉淀的發(fā)生，加溫溶解后要充分混勻（注意不要起泡）。
●EMB瓊脂培養(yǎng)基：高壓滅菌后，分注、凝固、干燥表面。
●卵黃甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基：將雞蛋放在95%酒精中浸泡1小時(shí)左右，用酒精棉（紗布）擦拭蛋殼表面，打開(kāi)雞蛋取出卵黃。加入經(jīng)高壓滅菌后冷卻到55-60℃培養(yǎng)基里（6%卵黃）攪拌搖勻凝固后干燥表面（攪拌時(shí)不要起泡）。若培養(yǎng)基溫度過(guò)高，卵黃凝固，過(guò)低則培養(yǎng)基分注時(shí)開(kāi)始結(jié)塊，所以操作要迅速。
※ 備注：分注后將平皿蓋打開(kāi)置于無(wú)菌工作臺(tái)/恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)使培養(yǎng)基表面干燥。
干燥時(shí)間基準(zhǔn)如下：
無(wú)菌超凈臺(tái)：15分鐘
37℃恒溫箱內(nèi)倒置：20-30分鐘
2.3 斜面/高層斜面培養(yǎng)基：
加溫溶解后的培養(yǎng)基分注到小試管3-4ml，中試管8-10ml。高壓滅菌后將試管冷卻至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），將試管口端擱在合適高度的器具上，擱置斜面長(zhǎng)度以不超過(guò)試管總長(zhǎng)一半為宜。高層斜面培養(yǎng)基制成斜面高1/3，高層為2/3。
●營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：加溫溶解后分注到中試管，高壓滅菌后制成斜面。
●TSI瓊脂培養(yǎng)基：加溫溶解后分注到小試管，高壓滅菌后制成高層斜面。
2.4 液體培養(yǎng)基
加溫溶解后的培養(yǎng)基和高層/斜面培養(yǎng)基一樣，分注。一般液體培養(yǎng)基因過(guò)度加熱易引起培養(yǎng)基變質(zhì),所以加熱（加溫溶解、高壓滅菌）后用流動(dòng)水等急速冷卻。
●EC、BGLB培養(yǎng)基：加溫溶解后分注到放有倒立的發(fā)酵管的試管后高壓滅菌，滅菌后用流動(dòng)水急速冷卻。
●EEM培養(yǎng)基：加溫溶解后于三角瓶在100℃滅菌30分鐘。
※ 備注：每批培養(yǎng)基制備后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、瓶塞被培養(yǎng)基污染等，均應(yīng)挑出棄去。培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好放于冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過(guò)一周，傾注的平皿培養(yǎng)基不宜超過(guò)3天。每批培養(yǎng)基均必須附有明顯的標(biāo)識(shí)。
3. 基本操作：
3.1 滅菌方法：
①酒精殺菌：用75%的酒精及酒精棉，用于手指、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、工器具、樣品外包裝等的殺菌。
②火焰滅菌：檢查中常用酒精燈/煤氣燈，將燒瓶、試管、吸管、剪刀、鑷子瓶口部或前端，還有接種針、接種環(huán)接種前后通過(guò)火焰。
③ 高壓滅菌：主要是吸管、培養(yǎng)基、稀釋水以及檢查完畢后的培養(yǎng)基等無(wú)菌。
④煮沸滅菌：在沸水中加熱15-30min的方法。用于鑷子、剪刀、吸球等的工具滅菌。
3.2.1 平皿劃線：
3.2.1.1分段劃線：用于含菌量較多的樣品。
右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，以達(dá)到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹底灼燒以免滅菌不徹底。（圖3-1、3-2）
用左手拇指和食指或中指使平皿開(kāi)啟成一縫，將滅過(guò)菌并冷卻的接種環(huán)挑取菌（可在瓊脂表面邊緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙）先在平板培養(yǎng)基的一邊輕輕研磨作第一次平行劃線，再轉(zhuǎn)動(dòng)平皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過(guò)第二次劃線部分作第三次劃線或通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。（圖3-3、3-4）
3.2.1.2連續(xù)劃線：含菌量不多的樣品。
先將接種環(huán)用火焰滅菌，待冷卻后挑取菌，涂于平板的上端，隨即向下連續(xù)平行劃線。（圖3-5）
※備注：
（1）劃線時(shí)接種環(huán)與平板表面所成的角度為45度角，以免劃破瓊脂。劃線要盡量直、密、勻而不重復(fù)。（圖3-7）
（2）將沾有菌苔的接種環(huán)在火焰上燒紅滅菌。先在火焰內(nèi)焰中燒灼，使其干燥后，再在外焰中燒紅，以免菌苔驟熱，使菌體爆濺，造成污染。（圖3-6）
3.2.2 涂布方法：
將菌懸液小心滴在平板培養(yǎng)基表面中央位置（圖3-8），右手拿無(wú)菌涂布棒平放在平板培養(yǎng)基表面，將菌懸液先沿一條直線輕輕來(lái)回推動(dòng)，使之分布均勻，然后改變方向沿另一條垂直線來(lái)回推動(dòng)，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂布棒再涂布幾次，使菌液均勻吸收 （圖3-9、3-11）。（或?qū)o(wú)菌涂布棒平放在平板培養(yǎng)基表面，將菌懸液沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展）使之分布均勻（圖3-10）。室溫下靜置5～l0min，使菌液滲透于培養(yǎng)基。
3.2.3 液體接種法
3.2.3.1 由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基：用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)在管內(nèi)靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩，或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。
3.2.3.2由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時(shí)：可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可。 （圖3-12、3-13）
※ 備注：
3.2.4 斜面接種法
將菌種斜面培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無(wú)名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對(duì)齊，應(yīng)斜持試管呈45～50度角，并能清楚地看到兩個(gè)試管的斜面，用右手的小指和手掌之間及無(wú)名指和小指之間撥出試管塞，將試管口在火焰上通過(guò)，以殺滅可能沾污的微生物。試管塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換無(wú)菌試管。
將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無(wú)菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，待冷卻后再?gòu)男泵嫔瞎稳∩僭S菌苔取出，接種環(huán)不能通過(guò)火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過(guò)火焰抽出管口，并迅速塞上試管塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊試管塞。將接種管做好標(biāo)記后再放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。
3.2.5 穿刺接種法
接種高層或半高層斜面培養(yǎng)管時(shí)，用接種針挑取菌落，向培養(yǎng)基中心穿刺，一直插到接近管底0.4cm處，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動(dòng)，以使穿刺線整齊，便于觀察生長(zhǎng)結(jié)果。（圖3-15、3-16）
