土霉素,金霉素,四環(huán)素

 

2、 儀器設(shè)備:

    帶熒光檢測器的高效液相色譜儀,

 

3、 試劑:

    除下列試劑外,使用附錄2所列試劑,

    咪唑:特級

    咪唑緩沖溶液:將68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸鎂溶解在800mL水中,用乙酸調(diào)節(jié)pH7.2后,加水至1,000mL,

    含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液:第1液:將21.0g檸檬酸溶解在水中至1,000mL,第2液:將71.6g磷酸氫二鈉溶解在水中至1,000mL,在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解,

    苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg):在內(nèi)徑8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色譜用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分離特性的物質(zhì),

 

4、 標(biāo)準(zhǔn)品:

    鹽酸土霉素:本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效價,分解點為190℃～194℃,

    鹽酸金霉素:本品1.000mg含有鹽酸金霉素0.900mg以上效價,分解點為210℃以上,

    鹽酸四環(huán)素:本品1.000mg 含有鹽酸四環(huán)素0.900mg以上效力,分解點為214℃以上,

 

5、 試驗溶液的制備:

    A．提取方法:

①肌肉、肝臟和腎臟

    肌肉:盡可能除去脂肪層,攪碎混合均勻后,稱取其5.00g,

    肝臟和腎臟:攪碎混合均勻后,稱取其5.00g,

    加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,攪拌1分鐘后,以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,水層移入100mL分液漏斗中,離心分離管的殘留物中 加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鐘后,按上述同樣條件離心分離,合并水層于上述分液漏斗中,加入20mL正己 烷, 用振蕩器激烈振蕩5分鐘后,以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,分取水層,

②脂肪

    脂肪:盡可能除去肌肉層,攪碎混合均勻后,稱取其20.0g,

    加入200mL正己烷,攪拌1分鐘后,加入40mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,再攪拌1分鐘后,以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,分取水層,正 己烷層中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鐘后,按上述同樣條件離心分離,分取水層,合并于先分取的水層中,

③奶

    稱取5.00g樣品,加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液和20mL正己烷,用振蕩器激烈振蕩5分鐘后,以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,分取水層,

④蛋

    除去蛋殼,充分均勻后,稱取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,均勻后,加入100mL正己烷,攪拌1分鐘后,以每分鐘3000 轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,水層移入100mL分液漏斗中,離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鐘后,按上述 同樣條件離心分離,合并水層于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振蕩器振蕩5分鐘后,以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,分取水層,

⑤魚貝類

    有殼貝類:除去殼,攪碎混合均勻后,稱取其5.00g,

    其它的魚貝類:攪碎混合均勻后,稱取其5.00g,

    加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,攪拌1分鐘后,以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,水層移入100mL分液漏斗中,離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鐘后,按上述同樣條件離心分離,合并水層于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振蕩器 激烈振蕩5分鐘后,以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,分取水層,

  B．凈化方法:

    在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中,順次注入 10mL甲醇、10mL水和5mL飽和EDTA溶液,棄去流出液,柱中注入a提取方法所得的溶液后,注入10mL水,棄去流出液,注入10mL甲醇,收集 流出液于磨口減壓濃縮器中,40℃以下除去甲醇,殘留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氫鉀溶液溶解,此為試驗溶液,

 

6、操作方法:

  A．定性試驗

    按下列操作條件進(jìn)行試驗,試驗結(jié)果必須與標(biāo)準(zhǔn)品的一致,

    操作條件:

    柱填充劑:十八烷基甲硅烷基化硅膠(粒度5μm),

    柱:內(nèi)徑4.0～6.0mm,長150mm不銹鋼管,

    柱溫: 40℃

    檢測器:激發(fā)波長380nm,發(fā)射波長520nm,

    流動相:土霉素和四環(huán)素試驗時,用咪唑緩沖溶液:甲醇(17:3)的混合溶液,調(diào)整流速使土霉素約5分鐘流出,

    金霉素試驗時,用咪唑緩沖溶液:甲醇(3:1)的混合溶液,調(diào)整流速使金霉素約7分鐘流出,

B．定量試驗

    根據(jù)與A定性試驗相同操作條件所得的試驗結(jié)果,峰高法或峰面積法定量,

 

7、定量限:

  A．肌肉,肝臟,腎臟,奶,蛋和魚貝類

    土霉素:0.02mg/kg

    金霉素:0.03mg/kg

    四環(huán)素:0.02mg/kg

  B．脂肪

    土霉素:0.005 mg/kg

 

8、注意事項:

  (1)試驗溶液的制備:

①離心分離溫度保持在室溫,

②抽濾后濾液混濁時,濾液再次進(jìn)行離心分離,

③在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色譜中,注入試驗溶液后,30mL水分?jǐn)?shù)次加入效果較好地洗浄柱中殘留的乙二胺四乙酸,

  (2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:

①稱取相當(dāng)于10.0mg土霉素的標(biāo)準(zhǔn)品,溶解在甲醇中至10mL,作為土霉素的標(biāo)準(zhǔn)原液（土霉素1,000mg（效價）／L,1,000mg／L）,本標(biāo)準(zhǔn)原液保存在-20℃,1年內(nèi)穩(wěn)定,

②稱取相當(dāng)于10.0mg金霉素的標(biāo)準(zhǔn)品,溶解在甲醇中至10mL,作為金霉素的標(biāo)準(zhǔn)原液（金霉素1,076mg（效價）／L,1,000mg／L）,本標(biāo)準(zhǔn)原液保存在-20℃,1年內(nèi)穩(wěn)定,

③稱取相當(dāng)于10.0mg四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)品,溶解在甲醇中至10mL,作為四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)原液（四環(huán)素1,082mg（效力）／L,1,000mg／L）,本標(biāo)準(zhǔn)原液保存在-20℃,1年內(nèi)穩(wěn)定,

④用1.36%磷酸二氫鉀溶液將土霉素,金霉素和四環(huán)素各標(biāo)準(zhǔn)原液遞減稀釋,作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的標(biāo)準(zhǔn)溶液,

  (3)其它:

①同時進(jìn)行很多樣品試驗的篩選試驗法提高判斷効率時,用「土霉素,金霉素和四環(huán)素的篩選法（參照117 頁）」判斷為陽性的,不妨用本檢測方法實施試驗,

②使用本檢測方法檢出土霉素,金霉素和四環(huán)素時,最好用帶質(zhì)量檢測器的高效液相色譜儀確證.