大多數(shù)微生物可用超低溫保存，超低溫保存法是適用范圍最廣的微生物保存法。需要復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)的微生物種，如用其他的貯存方法不能保持其活力（ 如植物的病原性真菌），通常可用超低溫的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是將凍存在小管或安瓿里的細(xì)胞以較慢的冷凍速率（1℃／分鐘）冷凍，直至—150℃，再將這些小管貯存在—150～－196℃的液氮中。

 

超低溫的冷凍保護(hù)劑不同于凍干法所用的冷凍劑。ATCC 常用一種由甘油（10％）、二甲

亞砜（5％）和培養(yǎng)液制成的混合劑保存多數(shù)的細(xì)胞株。這些化學(xué)試劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)可避免內(nèi)

膜的冷凍損傷。

貯存在低溫容器內(nèi)的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)必須小心操作。當(dāng)小管被加熱時(shí)，所形成的冰晶會(huì)將細(xì)

胞殺死，正確操作就可避免這種事故。只要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失，做法是：將封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打開(kāi)管口，將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基。

 

超低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環(huán)境中，因此需要液氮罐。在長(zhǎng)期貯存的過(guò)程中必須經(jīng)常注意補(bǔ)充液氮。這種貯存方式比凍干法需要更多的經(jīng)費(fèi)，包括為了維持貯存溫度所必要的勞動(dòng)力和液氮等。

2.2 材料

病毒超低溫保存所需材料有：熱收縮塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防護(hù)手套和面罩，永久性記號(hào)筆，氣體噴燈，裝液氮的保溫瓶。

2.3 方法

（1）剪一段兩端各超出冷凍管長(zhǎng)度2cm 的熱收縮塑料管。

（2）將含有澄清病毒懸液（組織培養(yǎng)的上清培養(yǎng)基，或組織培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物均可）冰浴幾分鐘，用滅菌移液管將0.2ml 冰浴過(guò)的上清懸液分裝到冷凍管內(nèi)，并將蓋子擰緊。

（3）將有病毒的冷凍管放入熱收縮塑料管中部，插入正確的標(biāo)簽。

（4）用噴燈小心加熱熱收縮塑料管，并使之包住冷凍管。注意不要用太高的溫度加熱熱收縮塑料管。

 

（5）再小心加熱熱收縮塑料管的兩端，用大號(hào)鑷子夾緊管的端口至完全密封。

（6）將密封好的冷凍管快速在裝有液氮的保溫瓶中冷凍（操作時(shí)要求戴面罩和手套）。

（7）將冷凍過(guò)的冷凍管放入液氮罐中的格子內(nèi)，同時(shí)記錄樣品的詳細(xì)的存放位置、實(shí)驗(yàn)編號(hào)和存放日期等。

（8）需要用時(shí)，迅速?gòu)囊旱�罐�?nèi)取出所需樣品，并投入37℃水浴箱中解凍后，用解剖刀片在冷凍管的硅化墊圈處切開(kāi)熱收縮塑料管。擰開(kāi)冷凍管的蓋子時(shí)不需要除去熱收縮塑料管。